【摘 要】
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目的:克隆慢性粒细胞白血病(CML)bcr/abl cDNA,构建真核表达载体pEGFP-bcr/abl,并观察其在哺乳动物细胞COS-7细胞中的表达。方法:选取慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞,利用RT
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目的:克隆慢性粒细胞白血病(CML)bcr/abl cDNA,构建真核表达载体pEGFP-bcr/abl,并观察其在哺乳动物细胞COS-7细胞中的表达。方法:选取慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞,利用RT-PCR方法,对bcr/abl的基因进行特异性扩增,将扩增产物分离、纯化,分别用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切鉴定,构建真核表达载体pEGFP-bcr/abl;利用脂质体转染的方法,将pEGFP-bcr/abl转染入哺乳动物细胞系COS-7细胞中,转染72h后用荧光显微镜观察COS-7细胞,并对其RNA及表达产物进行检测。结果:bcr/abl cDNA的PCR产物约为874bp,序列测定结果用BLAST软件进行同源性比较,同源性为100%,经EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切证实,bcr/abl cDNA已经成功克隆到加强型绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N3中。用脂质体介导法,将pEGFP-bcr/abl转染COS-7细胞,在荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的COS-7细胞,建立稳定分泌P210蛋白的阳性COS-7细胞克隆株,分离表达产物,进行Western-blot分析,在28kDa附近出现可被识别的条带。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-bcr/abl,并在哺乳动物细胞中得到表达,从而为进一步制备P210bcr/abl的单克隆抗体,探索人类CML诊断和治疗的新方法奠定了基础。
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