凹耳臭蛙(Odorrana tormota)人工培育试验与性别分子标记筛选

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凹耳臭蛙(Odorranatormota)隶属于两栖纲Amphibia无尾目Anura蛙科Ranidae臭蛙属Odorrana。其作为第一个被证实能发出并接收超声信号的非哺乳类脊椎动物且属于中国特有种,近年来引起国内外的广泛关注和重视。而过量的人为捕捉,产地生态环境的破坏等原因,致使凹耳臭蛙野生资源逐年下降,尤其是雌性个体的数量锐减。本文通过对凹耳臭蛙的消化系统进行解剖学观察,旨在对其人工培育过程中的饵料选择上起到借鉴作用。通过对凹耳臭蛙的性别分子标记筛选,旨在幼蛙阶段通过分子手段微损伤鉴定性别,从而实现早期确定个体性别、选择性培育不同性别个体,以满足相关科研需要。   通过开展凹耳臭蛙的人工培育试验,着重解决了以下几个技术难题:蝌蚪的登陆,幼蛙的开口饵料,开口饵料的投喂,幼蛙的越冬及人工培育环境下幼蛙易交叉感染病菌等。蝌蚪从登陆到尾吸收完成期间不摄食。登陆率81.7%,幼蛙越冬存活率14.3%。   对凹耳臭蛙消化系统进行了解剖学及组织学观察。消化道可以分为口腔、咽、食道、胃、十二指肠、回肠和直肠,末端开口于泄殖腔。肝脏和胰腺为消化腺。消化道管壁的组织结构均为4层结构,由管腔向外依次为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜。胃黏膜层中含有许多胃腺,可明显分为腺颈部和腺体部。小肠含有十二指肠腺,直肠含有直肠腺。肝脏发达,分为左、中、右3叶,肝小叶界限不明显。胰腺中的腺泡由腺细胞围成。凹耳臭蛙肠全长与头体长之比为0.44~0.91,是迄今为止报道的无尾两栖类中最小的。   合成220条随机引物,采用尾分析法检测与性别关联的RAPD标记寻找凹耳臭蛙性别鉴定的分子标记,筛选出39条能区分出雌雄DNA池的随机引物。其中分为三种类型:一种为雌雄只有雌或雄扩增出条带,一种为雌雄均扩增出条带,但长度不同,一种为雌雄扩增出长度相同的条带,需比较序列差异。其中A03最理想,但对此特异性引物进行个体验证时无法将全部雌雄个体区别开,雄性识别率为75%,则雌性存在假识别风险。因此,需要进一步完善性别分子识别标记的筛选。
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