论文部分内容阅读
研究背景:绒毛膜癌(简称绒癌)是由滋养细胞的异常增殖导致的高度恶性肿瘤,具有很强的破坏性,早期即可通过血行转移到全身其他部位,局部手术常常无法根治,目前临床以化疗为主。然而,与大多数肿瘤一样,多药耐药(MDR)现象的出现以及肿瘤复发是绒癌治疗失败的主要原因。所以有效逆转肿瘤已经形成的多药耐药是提高绒癌治疗成功率的关键。目前已知的由P-糖蛋白(P-gp)介导的耐药是肿瘤发生多药耐药的最主要的机制,而P-gp是由多药耐药基因 MDR1编码的耐药相关蛋白,所以 MDR1mRNA以及 P-gp是逆转耐药的研究靶点。研究发现,细胞因子具有广泛的生物学活性,应用重组细胞因子治疗恶性肿瘤疗效显著,并在一定程度上能提高化疗药物对肿瘤细胞的毒性作用。其中,IL-12因其强抗肿瘤效应而成为近年来备受关注的细胞因子之一。IL-12是由抗原提呈细胞(如巨噬细胞、单核细胞等)产生的一种蛋白类细胞因子,具有介导天然免疫、调节特异性免疫反应、诱导凋亡和刺激造血等功能。已有文献报道,外源性 IL-12能有效抑制绒癌细胞体外增殖,但对于耐药细胞株 JAR/MTX作用的研究罕见。本实验将通过形态学观察、电化学法检测HCG、细胞毒性实验等方法观察外源性IL-12对体外培养的绒癌耐药细胞株 JAR/MTX的毒性作用,以及与 MTX配伍后的协同增敏效应,探讨其在体外逆转绒癌细胞耐药的作用。并应用流式细胞术检测细胞内罗丹明123( rhodamine123,rh123, P-gp的特异性底物)积累量来反映P-gp的功能变化,以探讨外源性IL-12的耐药逆转作用与P-gp活性的关系。 研究目的:探讨外源性IL-12对绒癌耐药细胞株JAR/MTX的杀伤作用与逆转其耐药的效应及分子生物学机制。 实验方法:将绒癌耐药细胞JAR/MTX按如下分组:①对照组:单纯细胞、溶媒(DMSO+细胞);②药物组:细胞+MTX;③细胞因子组:细胞+外源性 IL-12;④药物+细胞因子组:细胞+MTX+外源性IL-12。各药物分别以5C及C(MTT法求得药物半数抑制浓度IC50作为C)处理细胞12小时、24小时后观察并收集细胞,并吸取细胞培养上清液,进行细胞的形态学观察、HCG的测定;与 MTX配伍后,运用RT-PCR和Western blot方法检测P-gp蛋白及MDR1mRNA的表达变化,应用流式细胞术检测细胞内荧光值强度的变化。 统计分析:定量测定数据以x±s表示。所有数据采用SPSS17.0 for windows软件进行处理。组间比较采用t检验,P<0.05为统计学上差异有显著性。 实验结果: 1.外源性IL-12在体外能有效抑制JAR/MTX细胞生长,其作用强于化学药物MTX。 2.低剂量的外源性IL-12即有明显抑制JAR/MTX细胞生物活性的作用,使细胞分泌β-HCG的量减少,而化学药物MTX高剂量时才有一定作用。 3.外源性IL-12(无毒剂量)与MTX联用后,能明显降低MTX的半数致死量,表明外源性 IL-12与MTX有较为显著的协同增敏作用,可能是因为药物具有多作用途径、多作用靶点的特点。 4.外源性IL-12在体外可逆转绒癌耐药细胞JAR/MTX对MTX的耐药,其耐药逆转作用与P-gp和MDR1基因的表达变化无关,但与P-gp的活性有关。外源性IL-12对绒癌耐药细胞JAR/MTX的耐药逆转机制之一可能为下调细胞内P-gp的活性。 结论:综上所述,本实验证明外源性 IL-12在体外通过多种作用途径有效抑制绒癌耐药细胞 JAR/MTX的生长及其生物活性(即抑制 HCG的分泌)。并初步揭示了外源性IL-12对绒癌耐药细胞JAR/MTX有耐药逆转作用可能与其下调了胞内P-gp的活性有关。据此可设想,外源性 IL-12很可能成为临床早期治疗耐药绒癌或是协同化疗药物提高疗效的新型药物。但直接应用时由于 IL-12可能的毒副反应,在用法用量以及用药时间的选择上都需要深入细致的研究才能最终推广。本研究旨在为临床治疗耐药绒癌的药物选择和耐药逆转剂的选择等方面提供了基础实验室依据和新的思路。