论文部分内容阅读
目前已知最为坚韧且有弹性的天然动物纤维之一——蜘蛛丝具有其它天然和人工材料无法比拟的超强刚性和出色的弹性。但由于蜘蛛无法高密度集群饲养而使得该方法无法大量获得蜘蛛丝。因此，本研究根据绵羊自身产生毛发角蛋白的特性，将人工合成的蜘蛛丝蛋白基因四聚体与绵羊毛发角蛋白启动子相连构建载体并转染绵羊皮肤成纤维细胞，通过G418筛选含有neo抗性基因的阳性细胞，获得转拖丝蛋白基因四聚体细胞株。为建立转基因细胞系，并通过体细胞核移植进一步产生转蜘蛛拖丝蛋白基因的克隆羊研究打下坚实基础。研究结果与结论如下： 1、绵羊角蛋白基因启动子的克隆:参照GenBank中启动子序列，采用PCR扩增技术，依次克隆到中间丝角蛋白基因启动子(K2.10)、高甘氨酸/酪氨酸蛋白基因启动子(KAP6.1)和高硫角蛋白基因启动子（B2A和B2C）; 2、绵羊角蛋白基因启动子的表达活性:将上述启动子与GFP报告基因连接，转染绵羊成纤维细胞。结果表明:中间丝角蛋白K2.10基因启动子、高甘氨酸/酪氨酸角蛋白KAP6.1基因启动子及高硫角蛋白B2C基因启动子的重组质粒转染后，检测到绿色荧光蛋白的表达，而高硫角蛋白B2A基因启动子未检测到GFP荧光。选择K2.10用于真核表达载体的构建; 3、绵羊角蛋白基因启动子真核表达载体的构建:将K2.10启动子与去除自身的CMV病毒启动子的pcDNA3.1载体连接，获得具有绵羊角蛋白基因启动子的真核表达载体; 4、拖丝蛋白基因真核表达载体的构建:将四聚化丝蛋白基因与绵羊角蛋白基因启动子真核表达载体相连接，通过特异性引物将四聚体丝蛋白及角蛋白启动子K2.10部分扩增后连接到去除自身CMV病毒启动子的pIRES2-EGFP载体上，获得拖丝蛋白基因真核表达载体，并对其线性化; 5、成纤维细胞的转染与筛选:采用阳离子脂质体法转染线性化的拖丝蛋白基因真核表达载体于原代培养的绵羊皮肤成纤维细胞中，利用G418筛选获得neo基因的抗性细胞; 6、对neo基因抗性细胞的鉴定:对G418筛选获得的抗性细胞，采用PCR方法鉴定表明所构建的载体整合到细胞基因组中，并对获得的阳性细胞进行了细胞生长曲线、群体倍增时间及细胞接种率的测定。与此同时，将转基因细胞冷冻后复苏，再次测定细胞生长曲线。以上结果均显示细胞曲线符合一般规律，转基因及冷冻未对细胞造成严重影响。 综上所述，采用上述方法，获得转蜘蛛拖丝蛋白四聚体基因绵羊成纤维细胞株。