人乳头瘤病毒(Human papillomaviruses, HPV)按病毒致癌能力的大小分为低危型HPV (HPV 6,11等)和高危型HPV (HPV 16,18等),低危型HPV主要引起良性外生性疣,宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasm, CIN),高危型HPV主要引起宫颈上皮内中、高度瘤变(CINⅡ、CIN Ⅲ)和宫颈浸润性鳞癌。女性最常见的恶性肿瘤之一是宫颈癌,在全球女性恶性肿瘤中仅次于乳腺癌居第二位。90%的宫颈癌患者可检测到高危型HPV DNA,宫颈癌的必备条件是持续高危HPV感染引起CIN病变持续和进展,从而导致癌症的发生。宫颈癌标本中,HPV 16、18型感染占70%以上,其中16型HPV占51.0%。HPV是小环状DNA病毒,其转化功能主要依赖于早期蛋白E7以及E6,其中E7降解抑癌蛋白pRb,释放与Rb结合的转录因子E2F,启动DNA复制所需蛋白的转录,引起细胞增殖紊乱与基因组不稳定性。在转基因鼠模型中,高度宫颈上皮内瘤变(high-grade cervical intraepithelial neoplasia, CIN Ⅲ)及宫颈癌的形成都依赖于HPV-16 E7的持续性表达。然而,我们对HPV E7的了解尚不充分。比如,HPV在分化的上皮细胞中复制,但HPV如何通过E7诱导分化细胞越过G0检验点进入S期,一直不十分清楚。细胞周期有序地进行在于细胞内存在cyclins, Cdks以及监控机制-细胞周期检验点。一旦检验点发生异常,则会导致基因组不稳定。GO检验点决定细胞能否进入G1及S期进行DNA复制,其调控主要是G0/G1早期Cdk4-Cdk6对pRb家族成员及其它底物的部分磷酸化及G0/G1晚期Cdk2对pRb的完全磷酸化。G0/G1检验点还受到细胞周期负向调控蛋白(cyclin-dependent kinase inhibitors)p27的调控。在血清饥饿等条件下,p27可以通过抑制cyclins/Cdk使细胞停滞在G0/G1期。p27活性是由p27磷酸化修饰调控,不同的信号通路调控p27不同位点的磷酸化,了解p27的不同位点磷酸化水平及信号通路调控方式,可以更好的了解p27的蛋白功能(蛋白稳定性、蛋白之间的相互作用、核浆定位)及蛋白活性；p27ser10的功能是调控p27的蛋白稳定性、细胞迁移和细胞周期；磷酸化的p27T198不仅影响p27的蛋白稳定性,还可影响p27与cyclin-Cdk2的结合力；p27Y88位点的磷酸化可减弱p27对Cdk2的抑制,p27T187调控p27的蛋白稳定性。尽管E7细胞在血清饥饿情况下上调p27的表达,但细胞仍然可以进入S期。最初人们认为E7蛋白直接结合p27从而使其灭活,但这一解释比较牵强,因为E7在细胞中的量很少而p27的量相对较高；后来有文献报道高危型HPV E7促进p27由胞核转移至胞浆,从而减少其在细胞核内同Cdk的结合,但机制不明；p27在第157位苏氨酸(T157)磷酸化可能对E7促进p27胞浆转移起重要作用,但缺少直接的证据。另外我们观察到E7细胞中p27在第10位丝氨酸(SIO)和第198位苏氨酸(T198)存在磷酸化,这两个位点的磷酸化在E7细胞中尚未被报道过,而T157磷酸化在E7细胞中并没有显著的提高。Mirk/Dyrk1B作为双特异性的络氨酸磷酸化调节激酶,能够通过催化自身络氨酸磷酸化而被激活,然后通过磷酸化下游蛋白的丝氨酸与苏氨酸而调控其功能。大部分人类正常组织中,Dyrk1B是低表达或不表达的；但在多种恶性肿瘤中Dyrk1B是高表达的,具有致癌基因的性质；敲低Dyrk1B可诱导细胞凋亡,增加癌细胞对抗癌药物的敏感性。但目前所知的Dyrk1B与细胞周期相关的主要生物学功能,是使细胞停滞在GO静止期的抑癌功能,这或许可以使细胞免受不利环境因素的影响,但其预期的促进细胞周期的功能尚未被发现。Dyrk1B在HPV相关细胞系或相关疾病中的研究尚未见报导。我们的研究结果表明,高危型HPV-16 E7上调Dyrk1B的表达。值得关注的是,Dyrk1B对E7表达细胞由静止期进入DNA复制期(S期)起正调控作用,高表达Dyrk1B促进这一过程,敲低Dyrk1B则抑制这一过程。这些结果揭示了Dyrk1B的新功能,提示利用Dyrk1B作为药物靶点的重大临床意义。我们的研究还解释了E7在p27蛋白表达量增高条件下,仍能越过G1/S检测点控制进入S期的机制。我们以HPV-16E7转染细胞系为研究模型,以血清饥饿(serum starvation)诱导抑制细胞增殖的信号,血清饥饿激活Dyrk1B激酶,Dyrk1B直接使p27ser10磷酸化,但是p27S10P在胞核表达量高,磷酸化的p27S10P通过与Cdk4结合能力的改变调控HPV-16 E7细胞在GO静息期越过G1/S检测点控制进入S期,促进细胞异常增殖,所以本研究有两个重要的靶点,与信号传导途径相关的Dyrk1B激酶和与细胞周期检测点调控失常相关的Cdk4激酶,针对上述靶点的相关药物设计及基因治疗方法的建立为在癌变早期阶段预防和治疗肿瘤提供理论依据。第一部分Dyrk1B调控HPV E7表达细胞在静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期的机制研究HPV-16 E7可以在基底层细胞分化、TGF-β、DNA损伤、血清饥饿、接触抑制等抑制细胞增殖信号刺激下诱导DNA复制。我们用血清饥饿诱导产生抑制细胞增殖、使细胞处于静止状态的信号,检测HPV E7表达细胞中细胞周期及细胞周期抑制蛋白p27的变化。1.BrdU检测结果表明,在血清饥饿诱导的GO静止期,RPE1 E7细胞与对照RPE1 vector细胞相比,RPE1 E7细胞能够越过G0/G1/S检测点控制进入S期。因为p27是细胞周期抑制蛋白,Western blot结果表明,静止状态下,RPE1 E7细胞p27蛋白表达水平比RPE1 vector细胞p27蛋白表达水平高。2.用液相色谱和串联质谱技术(LC/MS/MS)分析p27蛋白的翻译后修饰,鉴定出一个先前在其他细胞系中已知的磷酸化修饰位点p27S10P。p27蛋白的质谱分析结果提示,RPE1E7细胞静止状态下还可存在p27蛋白的其它磷酸化修饰,除了质谱检测出的p27S10P磷酸化修饰外,p27还可能存在其它磷酸化修饰。3.用p27的特异磷酸化抗体anti-p27S10P、anti-p27T157、anti-p27T187、 anti-p27T198检测并筛选了RPE1 E7细胞静止状态下越过G0/1/S检测点控制的磷酸化修饰,Western blot结果表明,静止状态下的RPE1 E7细胞可发生p27S10P、p27T157、p27T198位点的磷酸化修饰；HPV-16 E7静止状态下可特异性的诱导p27S10、p27T198的磷酸化。4.筛选RPE1 E7细胞静止状态下诱导p27S10、p27T198磷酸化的蛋白激酶,找寻RPE1 E7细胞静止状态下调控p27S10、p27T198磷酸化的信号转导通路。结合血清饥饿处理可以激活Dyrk1B蛋白激酶的活性特点；Dyrk1B可能是RPE1E7细胞静止状态下诱导p27S10、p27T198磷酸化的重要蛋白激酶。5. Dyrk1B蛋白激酶在RPE1 E7细胞中的表达量(mRNA和蛋白水平)、细胞定位、蛋白功能以及Dyrk1B调控HPV-16 E7蛋白稳定性研究。(1) Dyrk1B在E7细胞中的表达水平及细胞定位。比较RPE1 vector和RPE1 E7细胞,Dyrk1B无论是mRNA水平还是蛋白水平在RPE1E7细胞表达量都高于RPE1 vector细胞。Dyrk1B在饥饿处理下对 E7表达细胞进入S期似乎起正调控作用。可能是因为Dyrk1B的核浆定位发生了变化。Dyrk1B的核浆定位结果表明,RPE1 vector和RPE1 E7细胞以及血清饥饿处理前后,Dyrk1B均定位在细胞核。结论,HPV-16 E7促进Dyrk1B的表达,血清饥饿处理诱导Dyrk1B蛋白表达量和Dyrk1B蛋白活性的增加(p27蛋白表达量及磷酸化水平也随之增加)。(2) Dyrk1B在E7蛋白表达细胞中的蛋白功能：Dyrk1B调控E7蛋白表达细胞在静止状态下进入S期。结论,Dyrk1B对E7细胞在静止状态下进入S期起正调控作用。为验证Dyrk1B特异性的调控E7蛋白表达细胞在静止状态下进入S期,我们选择了三组肿瘤细胞系验证,第一组,HPV-16 E7蛋白表达宫颈癌细胞系CaSKi和SiHa;第二组,非HPV-16 E7但是HPV 18E7蛋白表达宫颈癌细胞系HeLa;第三组,非宫颈癌细胞系,即乳腺癌细胞系MCF-7；这三组细胞分别转染Dyrk1B siRNA/HA-Dyrk1B, BrdU-S期%检测细胞增殖情况。结论,Dyrk1B特异性的调控HPV-16 E7蛋白表达细胞在静止状态下进入S期。(3)本部分实验目的是研究Dyrk1B如何调控HPV-16 E7的,主要是Dyrk1B激酶调控HPV-16 E7基因和蛋白两方面。结论,尽管Dyrk1B激酶不影响HPV-16E7基因水平变化,但影响HPV-16 E7蛋白稳定性。6. Dyrk1B是RPE1 E7细胞静止状态下诱导p27S10、p27T198磷酸化的重要蛋白激酶,同时Dyrk1B特异性调控E7蛋白表达细胞静止状态下进入S期,所以这部分的研究内容一方面是Dyrk1B如何磷酸化修饰p27S10和p27T198,另一方面是p27S10、p27T198磷酸化修饰对E7蛋白表达细胞由静止状态下进入S期的影响。(1)p27S10P、p27T198P影响p27的蛋白稳定性。结论,PvPE1 E7细胞中,p27S10P不仅影响p27总蛋白的蛋白稳定性,而且影响p27T198的磷酸化水平；p27T198也可以影响p27总蛋白的蛋白稳定性,但不能影响p27S10的磷酸化水平。(2)p27S10、p27T198影响RPE1 E7细胞静止状态下进入S期。结论,RPE1E7细胞中,p27S10、p27T198磷酸化对RPE1 E7细胞静止状态下进入S期起正调控作用。第一部分研究结果表明,HPV E7细胞静止状态下在p27蛋白表达量高的情况下进入S期；E7细胞中p27蛋白在Serine 10、T198位点磷酸化程度比对照vector细胞增高,E7细胞中p27S10、p27T198磷酸化影响p27蛋白稳定性,所以可以解释为什么HPV-16 E7细胞GO静止期p27蛋白表达量高。p27S10、 p27T198影响E7细胞静止状态下进入S期,Dyrk1B是E7细胞静止状态下进入S期调控p27S10、p27T198磷酸化的重要蛋白激酶。因此,HPV-16 E7细胞在GO静止期,虽然p27蛋白表达量高,但仍能越过G0/G1期进入S期。第二部分Dyrk1B通过调控p27S10磷酸化修饰影响p27-Cdk4的结合从而调控HPV E7表达细胞在静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期机制探讨第一部分结果表明,Dyrk1B是E7细胞静止状态下进入S期调控p27S10、p27T198磷酸化的重要蛋白激酶,因为p27对cyclins-Cdks具有广泛的抑制活性,所以这一部分主要研究E7细胞静止状态下进入S期p27作为细胞周期抑制蛋白调控的cyclins-Cdks种类及Dyrk1B是如何通过p27S10、p27T198磷酸化参与调控cyclins-Cdks的。1.血清饥饿诱导的GO静止期,p27、P27S10P蛋白在胞核胞浆均有表达,但p27S10P的胞核表达量很高；p27-Cdk4、P27S10P-Cdk4蛋白复合体调控HPV E7表达细胞在静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期。(1)血清饥饿诱导的静止状态下检测p27蛋白的核浆分布,核浆分离结果表明,p27、p27S10P蛋白在胞核胞浆均有表达,但p27S10P的胞核表达量E7细胞比vector细胞高很多,说明p27S10P除了胞浆转移的功能,胞核高表达的p27S10P还具有其它的功能,比如磷酸化的p27影响了p27-Cdks之间的结合力。提示p27-Cdks蛋白复合体结合能力是调控HPV E7表达细胞在静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期的首要条件。(2)筛选E7表达细胞静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期,p27蛋白作用的Cdks,免疫共沉淀co-IP (Immunoprecipitation, co-IP)的结果证明,p27可结合Cdk1、Cdk2、Cdk4;与vector细胞相比,静止状态下,E7细胞p27-Cdk4的结合能力低于vector细胞p27-Cdk4的结合能力,但E7细胞p27-Cdk1、P27-Cdk2的结合能力比vector细胞高,而且Cdk4 siRNA降低了E7细胞S期%,所以调控E7表达细胞静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期的是Cdk4。2. Dyrk1B通过影响p27-Cdk4蛋白复合体的结合能力,调控HPV E7表达细胞在静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期。p27-Cdk4蛋白复合体调控E7表达细胞静止状态下细胞周期变化,Dyrk1B是E7表达细胞血清饥饿处理条件下影响p27蛋白磷酸化修饰及蛋白功能的重要蛋白激酶,所以Dyrk1B是否调控p27-Cdk4结合能力是这部分的研究内容。IP实验检测p27-Cdk4蛋白复合体的结合,结论,Dyrk1B降低p27-Cdk4结合能力调控HPV E7表达细胞静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期。3. Dyrk1 B磷酸化修饰p27S10P影响p27-Cdk4蛋白复合体的结合,调控HPVE7表达细胞在静止状态下越过G0/1/S检测点控制进入S期。(1)内源p27S10P-Cdk4结合能力检测。HPV E7表达细胞血清饥饿处理条件下,检测内源p27S10P-Cdk4结合能力。RPE1 vector细胞与RPE1 E7细胞血清饥饿处理下,IP实验检测内源p27-Cdk4结合能力,结果表明,RPE1 E7细胞血清饥饿处理下内源p27S10P-Cdk4结合能力明显低于RPE1 vector细胞组。(2)外源p27S10P磷酸化调控p27-Cdk4结合能力。血清饥饿处理条件激活Dyrk1B酶,Dyrk1B酶直接磷酸化p27S10P,该部分实验研究p27S10P磷酸化是否影响p27-Cdk4结合能力。p27WT、p27S10A、p27T198A、p27S10AT198A转染RPE1 E7细胞,IP实验检测外源p27-Cdk4结合能力,结果表明,p27S10A转染组与p27WT组比较,p27S10A组p27-Cdk4结合能力高于p27WT组。结论,p27S10P磷酸化降低p27-Cdk4结合能力；结合第一部分实验结果,结论是外源转染实验证明p27S10P磷酸化通过降低p27-Cdk4结合能力调控HPV E7表达细胞血清饥饿处理条件下越过G0/1/S检测点控制进入S期。(3)Dyrk1B-p27S10P磷酸化修饰调控HPV E7表达细胞血清饥饿处理条件下越过G0/1/S检测点控制进入S期。第一部分研究表明,p27S10P磷酸化修饰调控HPV E7表达细胞血清饥饿处理条件下越过G0/1/S检测点控制进入S期。这部分研究Dyrk1B与p27WT、p27S10A、p27T198A、p27S10AT198A共转染内源p27 siRNA敲除的RPE1 E7细胞,BrdU检测p27WT与p27S10A的S期%；BrdU结果表明,p27S10A的S期%低于p27WT的S期%。结论,Dyrk1B-p27S10P磷酸化修饰调控HPV E7表达细胞血清饥饿处理条件下越过G0/1/S检测点控制进入S期。4. Dyrk1B-Cdk4调控HPV E7表达细胞血清饥饿处理条件下越过G0/1/S检测点控制进入S期。(1) Cdkl siRNA、Cdk2 siRNA、Cdk4 siRNA转染RPE1 E7细胞,血清饥饿处理下检测S期细胞比例,BrdU结果表明,与对照NC组比较,Cdk siRNA转染组S期细胞比例均降低。(2) Dyrk1B与Cdkl siRNA、Cdk2 siRNA、Cdk4 siRNA共转染RPE1 E7细胞,血清饥饿处理下检测S期细胞比例,BrdU结果表明,与对照NC组比较,Cdk4以及Cdkl siRNA转染组S期细胞比例降低,而Cdk2 siRNA影响不大；结论,Cdk4调控HPV E7表达细胞血清饥饿处理条件下越过G0/1/S检测点控制进入S期。5.p27S10P磷酸化修饰不影响Cdk4-cyclin D1结合能力,说明p27通过其磷酸化修饰影响p27与Cdk4的结合能力足以反映细胞周期的变化。如前所述所得结论,p27 mutants通过影响p27与Cdk4的结合能力影响细胞周期的变化,为证明p27 mutants不影响Cdk4-cyclin D1结合能力,p27WT、p27S10A、p27T198A、p27S10AT198A共转染内源p27 siRNA敲除的RPE1 E7细胞,IP实验检测外源p27-Cdk4结合能力,结果表明,p27S10A转染组与p27WT组比较,p27S10A组Cdk4-cyclin D1结合能力与p27WT组比较变化不大。结论,p27S10P磷酸化不影响Cdk4-cyclin D1结合能力；结合前面的实验结果,结论是外源转染实验证明p27S10P磷酸化通过降低p27-Cdk4结合能力能够调控HPV E7表达细胞血清饥饿处理条件下越过G0/1/S检测点控制进入S期。6.Cdk4激酶活性检测。通过检测Cdk4底物RB的磷酸化水平,检测Cdk4激酶活性。