团头鲂是我国重要的草食性经济鱼类之一,目前由于过度捕捞等导致其野生种群数量急剧降低,种质资源退化,故加强优良品种的选育非常重要。而肌纤维的特性与动物肉质性状紧密相关,并且鱼类肌纤维的发育与哺乳动物有所不同:鱼类肌纤维数目的增加会持续整个生命周期,而哺乳动物肌纤维数目在出生前已固定,因此阐释鱼类肌纤维发育的变化规律及其分子机理对于揭示鱼类经济性状的遗传规律及优良品种的选育等具有重要作用。本研究采用组织学和免疫学等方法分析了团头鲂肌纤维发育和肌卫星细胞增值分化的规律;筛选出与团头鲂肌纤维发育相关的肌源性调节因子(Myogenic regulatory factors,MRFs);初步分析了团头鲂MRFs家族成员的起源进化及其在肌纤维发育中的作用;另外,分析了热休克蛋白(Heat shock protein 70,HSP70)和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)对团头鲂肌肉发育的影响,以此来加深对鱼类肌肉生长发育过程的认识,本研究主要结果如下:1.基于组织切片及免疫组化等方法显示,随团头鲂肌纤维发育日龄的增加,鱼体全长、体重、肌纤维长度、红白肌纤维直径和数目以及面积(增生和肥大面积)都显著增加;出膜后团头鲂红肌纤维出现在水平肌隔附近并呈单层分布,发育至15 dph(days post-hatching,dph),红肌纤维出现分层现象,表现为双层红肌纤维,并逐渐发育成多层红肌纤维,形成红肌群,同时还出现马赛克增生。发育至20 dph,白肌中较小纤维(直径<20 μm)分布逐渐增多,马赛克增生明显加强。35 dph时体高明显增大,鱼体接近成体形状。对1-龄和2-龄团头鲂肌纤维的分析中,发现轴上肌、水平肌隔红肌和白肌、轴下肌的直径范围,2-龄团头鲂中都大于1-龄团头鲂,且2-龄团头鲂较小肌纤维比例要显著低于1-龄团头鲂,然而较大肌纤维(直径>50 μm)比例就正好相反。此外,1-龄团头鲂红肌中的卫星细胞数目要显著高于白肌,但2-龄团头鲂中没有发现这一现象。团头鲂肌纤维发育的透射电镜结果表明,肌纤维按形态结构不同可以分为两种:位于外围呈带状的肌原纤维和处于中心呈多角状的肌原纤维。随着发育时期的推移,带状肌原纤维的长轴逐渐增加,而带状肌原纤维的短轴、多角状肌原纤维的长轴和短轴都没有显著变化。此外团头鲂肌纤维细胞核的长径和短径随着日龄的增加也没有显著变化。2.利用RT-PCR与RACE技术,克隆了团头鲂MRFs家族四个成员(MyoD、Myf5、MyoG和MRF4)的cDNA序列,其中MyoD基因955 bp,含有完整的开放阅读框(Open reading frame,ORF)828 bp,编码 275 个氨基酸,Myf5基因 ORF有723 bp,编码240个氨基酸;MyoG基因cDNA全长1367 bp,5’非翻译区(5’UTR)24bp,3’UTR 578bp,ORF为765bp,编码254个氨基酸;MRF4基因cDNA全长1196bp,3’UTR 476bp,ORF为720bp,编码239个氨基酸。通过比较各个基因的氨基酸、bHLH结构域(basichelix-loop-helix,bHLH)、H/C结构域(histidine/cystein rich domain,H/C domain)和 Helix Ⅲ 结构域(Carboxy-terminal amphipathic a-helix domain,Helix Ⅲ domain)等序列,得出团头鲂MRFs与其他鱼类的同源性较高,其中与草鱼、鲤等鲤科鱼类亲缘关系最近,与人和小鼠的亲缘关系最远。实时荧光定量 PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)分析显示 MyoD和Myf5基因在团头鲂各个组织中的表达趋势类似,其中在白肌中的表达量显著高于其它各组织,其次为心脏和脑,在性腺和肾脏中表达量最低;进一步分析显示两者在背鳍倾肌、尾鳍间辐肌和腹鳍肌中表达量最高。而MyoG基因仅在白肌、性腺、脾脏、脑和肝脏中表达,其中在白肌中表达量最高。同样地,MRF4基因在白肌中表达量显著高于其它各个组织,而在肾脏和脑中几乎检测不到表达;进一步对来自不同部位的肌肉组织检测发现MRF4在眼肌中表达量最高。对11个不同发育时期的表达检测结果显示MyoD和MRF4基因的表达情况类似,即在10 dph和20 dph的mRNA水平显著高于其它各个时期,其中MyoD基因在原肠早期的表达量也达到了高峰,随后逐渐降低至出膜期,接着逐渐升高。而MyoG直到体节生成期时才开始转录,晚于其它三个MRFs成员,且在体节生成期和12 hph(hours post-hatching)要显著高于其它各时期。另外Myf5基因在体节生成期的表达量也显著高于其它各个时期。3.进一步对MRFs基因家族的进化起源进行了预测分析,结果显示所有的MRFs同源氨基酸序列(来自322个两侧对称动物)分成了五大类,其中无脊椎动物MRFs同源氨基酸序列作为单独的一支,独立于脊椎动物MRFs序列,而脊椎动物的MyoD、Myf5、MyoG和MRF4同源氨基酸序列各聚为一支。此外还发现MyoD和Myf5这一大簇可能起源于盲鳗MyoD;另一个有趣的现象是,MyoG和MRF4这一大簇可能起源于“活化石”矛尾鱼MRF4-1,而矛尾鱼的MRF4-2则与其它脊椎动物的MRF4聚为一起。MRFs的四个成员都出现在两侧对称动物的基因组中,其中只有MyoD、MyoG和MRF4存在于无颚类脊椎动物中。而在无脊椎动物中,也只发现了MyoD、Myf5和MyoG同源氨基酸序列。有趣的是,在紫海胆和文昌鱼基因组数据中,我们运用双向比对法发现,它们分别存在两种MRFs同源基因,分别是(Sp-MyoD和Sp-MyoD)和(Amphi-MyoD和Amphi-MyoD1)。基因线性分析结果表明四个MRFs家族成员基因在选取的物种中都属于直系同源基因。此外对四个MRFs成员结构域的起源和进化分析显示转录激活结构域(Transcriptional activation domain,,TAD)和 H/C 结构域分别最早出现在圆口类盲鳗和软体动物海蠕虫中。而较为保守bHLH和Helix Ⅲ结构域最早出现在秀丽隐杆线虫中。4.成功构建了团头鲂pET28a-HSP70原核表达载体,获得了活性蛋白。在对团头鲂注射不同浓度的HSP70重组蛋白1 d后,检测到肌肉中相关基因的表达量都发生显著变化,其中MyoG的表达量在高浓度组中(3.4 mg/mL)显著升高。MyoD、Myf5和MRF4的表达相反,即在高浓度中表达量都显著低于对照组。而MSTNa和MSTNb的表达量随着浓度的增加先降低后升高,但MSTNb的表达量要显著高于MSTNa。另外低浓度组(1mg/mL)红肌和白肌中的肌卫星细胞频率都显著高于其它两个浓度组。另外本研究也分析了 LPS对团头鲂肌肉相关基因表达的影响。在LPS高浓度组(1.2 mg/mL)和对照组中,MyoD、Myf5和Pax-7基因在红肌中的表达量分别在注射后7 d时显著高于其它两个时期。而白肌中,在LPS注射3d之后,MyoG和Pax-7具有相似的表达趋势,随着浓度的升高,两个基因的表达量先升高后降低;而MyoD,Myf5和MSTNb的表达逐渐降低。此外在红肌中,LPS注射组中肌卫星细胞的频率都要显著高于对照组。然而在白肌中,LPS注射3d后,低浓度组中的肌卫星细胞的频率要显著高于其它组,而高浓度组间的肌卫星细胞的频率却没有显著性差异。