背景及目的心肌纤维化（Myocardial fibrosis,MF）是高血压病、缺血性心脏病、瓣膜心脏病以及心肌病等多种心血管病发展至终末期共同病理生理改变,其主要病理生理基础是心肌成纤维细胞（Cardiac fibroblasts,CFs）的异常增殖及细胞外基质过多合成和沉积,导致心脏收缩及舒张功能障碍,最终出现严重的心力衰竭,给患者及社会带来承重的经济负担。因此加强对心肌纤维化机制研究,挖掘有效的干预靶点对防治心力衰竭具有重要意义。国内外研究表明,Wnt/β-Catenin信号通路与心肌纤维化作用存在密切联系,Lgr5作为Wnt/β-Catenin信号通路的受体,可以通过与R-spondin配体结合激活Wnt/β-Catenin信号通路。因此本研究提出以下理论假设:在心肌纤维化发生发展过程中,Lgr5通过与R-Spondin配体结合从而激活Wnt/β-Catenin信号通路,β-Catenin积累入核与TCF/LEF结合调控靶基因转录,从而参与调控心肌纤维化发生。本实验研究通过建立血管紧张素II（Angiotensin,Ang II）诱导CFs纤维化模型,利用Lgr5-siRNA转染CFs,观察Lgr5-siRNA对CFs增殖、转分化以及胶原合成影响,并检测Wnt/β-Catenin信号通路相关分子表达情况,探究Lgr5调控Wnt/β-Catenin在心肌纤维化中的作用,研究结果可望为防治心肌纤维化、心力衰竭提供新的干预靶点。方法:1、心肌成纤维细胞的的原代分离、培养及鉴定实验选择出生1³天C57BL/6乳鼠,采用胰酶消化结合差速贴壁方法,原代分离及培养小鼠心肌成纤维细胞,利用波形蛋白（Vimentin）结合免疫荧光鉴定心肌成纤维细胞纯度。2、AngⅡ诱导体外心肌成纤维纤维化细胞模型实验采用CCK8试剂盒检测不同浓度Ang II对CFs增殖影响,结合Western blotting以及实时荧光定量PCR检测collagen I/collagenⅢ蛋白及mRNA表达,寻找诱导心肌纤维化细胞模型的血管紧张素Ⅱ最适浓度,实验分为5个组进行实验:对照组、Ang II(1×10^-8mol/L)、Ang II(1×10^-7mol/L)、Ang II(1×10^-6mol/L)、Ang II(1×10^-5mol/L)。3、Lgr5-siRNA对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖及细胞转分化影响实验采用CCK8试剂盒、免疫荧光、Western blotting等方法观察Lgr5-siRNA对AngⅡ(1×10^-6mol/L)诱导的CFs增殖及转分化的影响,实验分为4个组进行实验:对照组、Ang II、Ang II+Lgr5-scRNA、Ang II+Lgr5-siRNA。4、Lgr5-siRNA对心肌成纤维细胞功能及Wnt/β-Catenin通路相关信号分子表达影响利用Western blotting以及实时荧光定量PCR实验方法,观察Lgr5-siRNA对CFs分泌胶原蛋白功能及Wnt/β-Catenin通路相关信号分子表达影响,实验分为4个组进行实验:对照组、Ang II、Ang II+Lgr5-scRNA、Ang II+Lgr5-siRNA。结果:1、心肌成纤维细胞的的原代分离、培养及鉴定显微镜下CFs形态呈现不规则形、长梭形或者椭圆形。培养3⁴d后心肌成纤维细胞明显增殖,融合状态,镜下可见成纤维细胞呈长梭形。利用免疫荧光检测,在倒置荧光显微镜下小鼠CFs波形蛋白（Vimentin）抗原表达呈阳性反应,阳性细胞率约为96%,Vimentin鉴定所培养的CFs纯度高,适合于实验。2、AngⅡ诱导诱导体外心肌成纤维细胞模型CCK8检测结果显示CFs在不同浓度AngⅡ作用24小时后,CFs增殖能力随AngⅡ浓度增加而增加,AngⅡ在1×10^-6mol/L、1×10^-5mol/L细胞增殖能力明显增加,差异具有显著意义（P<0.05）。实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测collagen I/collagenⅢmRNA的表达水平,与对照组比较,AngⅡ浓度在1×10^-6、1×10^-5mol/L具有显著差异（P<0.05）。Western blotting测定各组collagen I/collagenⅢ蛋白的表达水平,与对照组比较,AngⅡ1×10^-6、1×10^-5mol/L能显著提高collagen I/collagenⅢ蛋白表达,且差异具有统计学意义（P<0.05）。3、Lgr5-siRNA对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖及细胞转分化影响CCK8检测结果显示:与对照组相比,AngⅡ组(1×10^-6mol/L)作用后CFs在A₄₅₀值显著增加,具有统计学意义（P<0.05）,与AngⅡ组相比,AngⅡ+Lgr5-scRNA组A₄₅₀值无统计学意义（P>0.05）,但AngⅡ+Lgr5-siRNA组A₄₅₀值明显降低（P<0.05）。免疫荧光结果显示:对照组中α-SMA蛋白免疫荧光染色阴性;AngⅡ组、AngⅡ+Lgr5-scRNA组中的α-SMA免疫荧光染色均阳性;两组间差异无统计学意义（P>0.05）,与AngⅡ组比较,AngⅡ+siRNA组中的α-SMA绿色荧光表达明显减少（P<0.05）。通过Western blotting分析结果显示α-SMA蛋白水平与免疫荧光结果相符合。4、Lgr5-siRNA对成纤维细胞功能及Wnt/β-Catenin通路相关信号分子表达影响Western blotting以及RT-PCR结果表明:与对照组相比,AngⅡ能诱导心肌成纤维细胞collagen I、collagenⅢ、TIMPs、Lgr5、β-Catenin的mRNA及蛋白表达明显增加,同时降低MMPs mRNA及蛋白表达,差异具有统计学意义（P<0.05）。经Lgr5-siRNA干预后,与AngⅡ组比较,collagen I、collagenⅢ、TIMPs、Lgr5、β-Catenin mRNA及蛋白表达明显降低,MMPs mRNA及蛋白表达明显升高。结论:1.Lgr5-siRNA能明显抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖,并抑制心脏成纤维细胞转化成肌成纤维细胞。2.Lgr5-siRNA可能通过下调Wnt/β-Catenin信号通路,从而抑制心肌成纤维细胞分泌collagen I、collagenⅢ、MMPs,从而减轻心肌纤维化。