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核酸作为遗传物质,对生物的生存和繁衍至关重要。核酸代谢包括合成与分解代谢。核酸合成代谢主要由DNA、RNA聚合酶和核苷酸合成酶等多种酶催化完成。相反,核酸分解代谢的酶学基础是核酸酶和核苷酸水解酶等。细胞内多种核(苷)酸水解酶参与DNA合成错误校正、DNA损伤修复、RNA成熟与降解再循环等核酸代谢反应。DHH磷酸酯水解酶(DHH超家族蛋白),是一大类能够水解磷酸酯键的酶的总称,参与多种核酸代谢过程。DHH磷酸酯水解酶不同亚家族间的氨基酸序列保守性很低,但均具有一个由3个连续氨基酸残基DHH(即天冬氨酸-组氨酸-组氨酸)构成的保守motif,故统称为DHH超家族蛋白。Rec J核酸酶就属于DHH超家族蛋白的一个分支,它是一类在细菌和古菌中都高度保守的蛋白。真核生物没有Rec J核酸酶,但是编码一个没有核酸酶活性的CDC45蛋白。细菌Rec J核酸酶,存在于几乎所有细菌中,能够特异性的从5’到3’方向降解单链DNA。一些古菌,除泉古菌外,也编码Rec J同源蛋白。古菌Rec J与细菌Rec J在氨基酸序列和结构域组成上存在显著差异,来自古菌Thermococcus kodakarensis和Pyrococcus furiosus的Rec J核酸酶具有5’到3’方向降解单链DNA的核酸酶活性。有趣的是,一些古菌编码不止一个Rec J核酸酶,比如Methanomicrobia、Methanococci、Methanobacteria和Archaeoglobi纲古菌,它们都同时编码两个Rec J核酸酶;也有不编码Rec J的菌株,如Aeropyrum pernix,暗示Rec J在古菌中具有分布的多样性。为了进一步研究古菌Rec J核酸酶的生物学功能,我们拟以产甲烷古菌Methanocaldococcus jannaschii(M.jannaschii)编码的2个Rec J为研究对象,重点开展体外酶学特征与蛋白结构研究,最终在氨基酸序列保守性、结构域组成模式、晶体结构等层面解析M.jannaschii的2个Rec J核酸酶的酶促反应特征异同。本文研究表明古菌M.jannaschii编码的两个Rec J核酸酶具有相反的单链核酸水解极性。长的Mja Rec J1(MJ0977)具有5’到3’方向的外切核酸酶活性,倾向于水解单链DNA;而短的Mja Rec J2(MJ0831)具有3’到5’方向的外切核酸酶活性,倾向于水解单链RNA。5’末端磷酸基团会促进Mja Rec J1活性;然而,3’末端磷酸基团会抑制Mja Rec J2的酶活。此外,DNA复制体(replisome)Go-Ichi-Ni-San(GINS)和Mja Rec J1/Rec J2都没有相互作用,也不会促进后两者的酶切活性。M.jannaschii的这一特性与已报道的Thermococcus属古菌的GINS与Rec J能形成蛋白复合物GINS-Rec J的特性不同。最后,Rec J家族蛋白的分子进化树分析暗示:相比细菌Rec J,古菌Rec J和真核CDC45在进化上具有更近的亲缘关系。为了进一步探究古菌Rec J的酶促反应机理,我们解析出了Mja Rec J2晶体结构。Mja Rec J2晶体结构与Thermococcus属古菌Tko GAN、以及人CDC45拓扑结构相似。然而,Mja Rec J2具有独特的二聚体构型,其二聚体界面和Mja GINS潜在的相互作用界面重合,阻碍了Mja GINS和Mja Rec J形成复合物。氨基酸定点突变破坏Mja Rec J2二聚体界面上的相互作用残基后,使得Mja Rec J2以单体形式存在,并能和Mja GINS相互作用。同时,我们还解析出了Mja Rec J2分别与金属离子Mg2+、底物d AA、产物d CMP的三个共晶结构,确定了重要的相互作用残基,为下一步在结构层面解析Mja Rec J2核酸酶的酶促反应机理提供了基础与依据。本文的研究结果拓展了Rec J核酸酶家族蛋白功能和结构的多样性,加深了对古菌Rec J和真核CDC45蛋白进化关系的认识。