噬菌体是一种细菌病毒,其数量达到1030之多,它是目前生物圈中存在数量最多的一类微生物,也是一类宝贵的生物资源。噬菌体在治疗细菌感染、耐药病原菌的快速检测、细菌分型、食品中细菌的控制、治理环境污染、控制病原菌传播以及分子生物学研究等方面是一个非常有潜力的工具。尤其在临床上,目前的结核分枝杆菌常规检查耗时长,而利用分枝杆菌噬菌体开发出来的新型检测试剂盒却大大缩短了结核病的诊断时间,为病人赢得了宝贵的治疗时间。但是,近年来病原菌对噬菌体耐受现象逐渐显现,这给原本前途一片光明的噬菌体治疗和诊断蒙上了一层阴影。本研究想利用耻垢分枝杆菌作为模式菌株,探究结核分枝杆菌对于噬菌体的耐受机制,得到了如下实验结果：我们利用裂解性分枝杆菌噬菌体TM4作为筛选条件,成功筛选到了对TM4和SWU1噬菌体耐受的耻垢分枝杆菌Tn5转座子突变株,根据其在突变库中的位置命名为M12。通过将SWU1的基因组电转入M12突变株,发现在噬菌体培养双层平板上能够看见浑浊的噬菌斑,这表明M12对噬菌体SWU1的耐受发生在噬菌体吸附或者DNA注入这一步。接下来,通过透射电镜观察M12突变株对SWU1噬菌体的吸附情况,证实M12转座子突变株抑制了SWU1噬菌体的吸附。我们还分析了M12突变株的单菌落形态,M12与野生型耻垢分枝杆菌相比,单菌落形态差异比较明显,主要表现为菌落表面光滑、有光泽、边缘整齐、无褶皱,而野生型耻垢分枝杆菌单菌落形态表现为边缘不整齐、表面无光泽、且有褶皱。这进一步提示或许由于M12细胞壁成分的改变而引起单菌落形态的改变,并且使得M12阻止SWU1噬菌体吸附,从而显示出宿主对噬菌体的耐受表型。于是,我们接下来通过进一步检测M12和野生型耻垢分枝杆菌细胞壁脂肪酸成分,发现M12与野生菌株相比,脂肪酸成分虽然没有显著差异,但各成分之间含量差异较大。之后,利用热不对称交错PCR（TAIL-PCR）的方法,成功鉴定了M12突变株中Tn5转座子插入位点位于耻垢分枝杆菌基因组上MsMEG₃705基因中。紧接着,通过Xer-cise系统,我们构建了MSMEG₃705敲除菌株,利用PCR的方法,在MSMEG₃705上下游250bp处设计特异性引物,对扩增产物送BGI测序,测序结果验证成功构建了MSMEG₃705全基因敲除菌株。通过检测了MSMEG₃705敲除菌株对SWU1的敏感性,发现MSMEG₃705敲除菌株没有恢复M12转座子突变株对噬菌体耐受的表型。据此,初步得出结论,M12转座子突变株的噬菌体耐受表型,与Tn5插入到MSMEG₃705基因上导致该基因功能的丧失无直接的联系。推测M12耐受TM4、SWU1的机理可能是因为M12自发突变,导致宿主上噬菌体受体的缺失或者改变而形成耐受表型。另一方面,拿到MsMEG₃705敲除菌株后,进一步分析了MSMEG₃705基因的功能。通过对MSMEG₃705蛋白序列的BLAST比对分析,结果发现与MSMEG₃705蛋白同源性较高的7个分枝杆菌假定蛋白都属于主要辅助转运蛋白家族。进一步通过跨膜结构域和三维结构预测分析MSMEG₃705编码蛋白,结果发现该蛋白具有该家族典型的12个α螺旋跨膜结构域,且三维结构成圆桶状,这与已经进行晶体结构解析的主要辅助转运蛋白超家族（MFS）蛋白相一致。生物信息学分析证实了MSMEG₃705的确属于MFS蛋白家族。我们测定了MSMEG₃705突变株对10种常见分枝杆菌抗生素和5种金属离子的最低抑菌浓度（MIC）,实验结果指明MSMEG₃705敲除菌株对对卷曲霉素敏感性提高2倍,但对利福平表现出耐受,其MIC是野生型的2倍。M12对其他大部分抗生素MIC相较于野生型对照无显著变化,这指明一MSMEG₃705基因在耻垢分枝杆菌外排卷曲霉素中发挥着重要作用。通过对野生菌株和缺失菌株胞内溴化乙锭的积累分析,发现MSMEG₃705基因编码的外排泵蛋白在耻垢分枝杆菌外排EB过程中也扮演着重要角色。在本研究中,我们还发现MSMEG₃705敲除菌株比野生型耻垢分枝杆菌在同样条件下提前进入对数生长期,RT-PCR结果指明MSMEG₃705基因敲除影响了下游基因MSMEG₃706的表达。