第一部分超声造影定量分析评价小鼠Lewis肺癌肿瘤血管的生成研究背景及意义肿瘤血管生成即指在肿瘤原有微血管网的基础上通过内皮细胞的“芽生”方式形成新生血管的过程,它是肿瘤生长和转移的一个至关重要的因素。在肿瘤内及周围的血管生成被认为是恶性肿瘤细胞增殖的前提,这些新生血管不但能够提供肿瘤细胞增殖所需的营养,也为肿瘤细胞在体内的远处转移提供了通道。所以血管生成是恶性肿瘤的重要特征,它的检出对于肿瘤的诊断、治疗与预后相当重要。在过去的几年中,许多研究通过无创的影像学方法来评估肿瘤血管的生成,例如对比增强计算机断层扫描(contrast enhanced computed tomography, CECT)、动态对比增强磁共振成像(dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging, DCE-MRI),磁共振血管成像技术(magnetic resonance angiography, MRA）、正电子发射断层扫描(positron emission tomography,PET)和多普勒超声诊断技术等等。然而,以上这些方法在检测低速血流和微小血管上,具有明显的局限性。超声造影明显提高了对低速血流的检出能力,使评价组织内毛细血管和微血管的血流成为可能,并可提供关于肿瘤血管的详细信息。微血管密度即平均每平方毫米肿瘤面积内的血管数,是目前评价肿瘤血管生成的公认的参考标准。然而不同血管内皮细胞标记的微血管密度用于揭示不同肿瘤血管内皮细胞的分化程度以及结构和功能特点。在以往的实验研究中,较多使用CD31血管标志的微血管密度,用以评价组织的血管生成情况。由于CD31微血管密度在已分化和未分化的血管内皮细胞中均有表达；而另一常用的血管标记物CD34则只表达于已分化的内皮细胞中,故肿瘤血管的分化程度不同,其所代表的微血管密度亦有不同。小鼠Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma, LLC)是将传代培养的Lewis肺癌细胞接种于C57/BL6小鼠的腋部皮下而成,已经多次反复应用于实验室的各项研究中,是较为成熟的动物瘤实验模型。虽然既往已有研究证实超声造影的定量分析参数与肿瘤的微血管密度存在一定的线性相关关系,到目前为止,还未有报道关于小鼠Lewis肺癌中不同血管标记的微血管密度同超声造影参数之间的相关性研究。研究目的本研究通过建立小鼠LLC的皮下移植瘤动物模型,应用增强脉冲序列(contrast pulse sequencing, CPS)的超声造影成像技术,结合时间-强度曲线,研究并比较超声造影的血流灌注参数与不同血管标记的微血管密度在LLC动物实验模型中的相关性,探讨超声造影在评价肿瘤血管生成方面的应用价值。研究方法建立25只小鼠LLC皮下移植瘤模型,待肿瘤大小约1.0cm左右行超声造影检查,应用超声造影定量分析软件进行脱机分析,获取峰值强度(peak intensity,PI)、达峰值时间(time to peak, TTP)和到达时间(arrival time,AT)等超声造影定量分析参数。超声检查结束后经颈椎脱位处死小鼠,完整切除肿瘤,免疫组织化学法分别检测肿瘤的CD31及CD34微血管密度的表达情况,并分别计算出微血管密度值(microvessel density,MVD)。结果1.接种后7天出现肉眼可见的肿瘤,模型建立成功。肿瘤的平均直径约0.9cm,最大直径为1.3cm,大多呈椭圆形,成瘤率达100%,且无一例复种。2.25例小鼠LLC的超声造影增强模式均表现为环状强化,即肿瘤组织周边部明显强化,而中央部呈现低强化或无强化。在时间-强度曲线上上述LLC肿瘤均呈现“快进、慢出”的表现,即上升支陡直,迅速达峰,下降支相对较缓。3.在小鼠的LLC肿瘤中,存在两种代表血管内皮细胞不同分化程度的血管标记物：CD31和CD34.4.超声造影的灌注参数峰值强度(PI)与CD31微血管密度呈正相关(r=0.428;P<0.05)与CD34微血管密度无线性相关。5.在小鼠的LLC肿瘤中,CD31微血管密度与CD34微血管密度呈负相关(r=-0.474;P<0.05)。结论1.本实验成功建立了小鼠Lewis肺癌的肿瘤模型,进一步证明了该模型是研究组织肿瘤的可靠实用的动物实验工具,并具有较好的可重复性。2.在小鼠Lewis肺癌肿瘤模型中,存在两种不同分化程度的肿瘤血管：分别是代表未分化和已分化成熟血管内皮细胞的CD31微血管密度和只代表分化成熟的血管内皮细胞的CD34微血管密度。3.超声定量分析参数与肿瘤微血管密度的相关性提示：超声造影(团注法)可以通过监测肿瘤的血流灌注参数来有效评价肿瘤血管生成；其中超声造影参数中的峰值强度可以在一定程度上评价肿瘤未分化的血管生成,指导临床应用抗血管治疗以及评估肿瘤的分级和预后上有着重要的临床实用价值。第二部分超声造影定量分析评价恩度对小鼠Lewis肺癌肿瘤的治疗疗效研究背景及意义抗肿瘤血管生成治疗是目前治疗肿瘤的研究热点和重点。由于抗肿瘤血管生成治疗的靶向作用于肿瘤内异常的新生血管或不成熟血管,其治疗会引起肿瘤内血容量、血流灌注速度及其它血流动力学指标的改变,监测这些血流动力学指标的改变成为临床上评价抗血管生成治疗的有效指标。既往多种影像学检查方法(如CT、 MRI及超声等)都曾来评价肿瘤血管的生成和抗肿瘤血管生成治疗的疗效。超声检查尤其是彩色多普勒超声由于具有实时、费用低、重复性好以及能直接评价肿瘤的血流灌注等优点,在评价肿瘤血管生成及抗血管生成治疗中起着重要的作用。但彩色多普勒超声对微血管的显示及评价微血管的血流灌注有一定的局限性,近年来超声造影更多的应用于临床,使对肿瘤内微小血管内血流的评价成为可能。在一定浓度范围内,超声造影的信号强度与血液内微泡浓度存在线性关系,故可利用时间-强度曲线软件对超声造影过程进行定量分析。恩度(endostar)即重组人血管内皮抑素,是一种血管生成抑制药物,其可能作用机理是通过抑制血管内皮细胞的增殖、迁移达到抑制肿瘤新生血管的生成,阻断了肿瘤细胞的营养供给,从而达到抑制肿瘤的目的。临床主要应用于非小细胞肺癌的抗肿瘤血管生成治疗。由于血管生成抑制药物主要作用于肿瘤内的异常新生血管,治疗后不仅会引起组织内血管数目的变化,更重要的是会引起肿瘤血管的形态、以及功能的改变,上述改变往往继发了肿瘤内血流动力学的异常,因此监测此异常变化可以成为临床上评估抗血管生成治疗的一个可靠手段。研究目的本研究拟采用Lewis肺癌荷瘤小鼠模型应用腹腔内注射抗血管药物恩度治疗后与对照组的超声造影血流灌注参数进行对照性研究,并将超声造影参数与肿瘤的微血管密度进行相关性比较,旨在探讨超声造影对评价抗肿瘤血管生成药物疗效的作用。研究方法建立30只小鼠LLC皮下移植瘤模型,随机分为2组,各模型自建立次日起分别经腹腔注射生理盐水钠(normal saline, NS)、恩度(5mg/kg体重),每天给药,连续给药14天。用药后每天观察两组小鼠的一般情况,并每隔一天测定小鼠肿瘤的大小。末次给药24h后行超声造影检查,并应用超声造影定量分析软件进行脱机分析,获取峰值强度(PI)、达峰时间(TTP)和到达时间(AT)等参数。超声检查结束后颈椎脱位处死小鼠,并完整切除肿瘤,免疫组织化学检测肿瘤CD31的表达情况,并计算肿瘤的微血管密度(MVD)。1.接种后7天出现肉眼可见的肿瘤,模型建立成功,肿瘤的平均直径约为0.9cm,最大直径1.3cm,大多呈椭圆形,成瘤率达100%,且无一例复种。2.对小鼠一般情况的影响用药后生理盐水组小鼠随着移植瘤结节的逐渐长大,进食、饮水、活动均较前减少;恩度组小鼠进食、饮水较前无明显变化,活动正常,持续到实验结束。实验结束后,恩度药物干预组小鼠LLC皮下移植瘤体积(1762.72±53.08mm3)明显低于生理盐水对照组(2503.72±64.78mm3),两组之间有统计学差异(p<0.05)。3.对移植瘤微血管密度的影响以CD31作为血管内皮细胞的标志物,血管内皮细胞的胞浆被染成棕黄色。NS组及恩度组CD31MVD计数平均值分别为98.50±13.53、56.21±5.10。与NS组比较,恩度药物干预组MVD值减低且差异具有显著性(p<0.05)。4.超声造影软件定量分析实验结束后,恩度治疗组的峰值强度(PI)明显低于生理盐水对照组(p<0.05),其峰值强度分别为50.74±5.82及88.56±25.99。5.超声造影的定量分析参数与肿瘤微血管密度之间的关系实验结束后恩度组超声造影参数峰值强度(PI)与肿瘤的CD31微血管密度呈正相关(r=0.532,p<0.05)。结论1.重组人血管内皮抑素(恩度)能够有效抑制小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的生长。2.超声造影定量分析(团注法)可以通过监测肿瘤的血流灌注参数的改变来评价恩度抗血管生成治疗的效果。3.超声造影定量分析参数中的峰值强度可以有效反映恩度抗血管生成治疗引起的肿瘤血流灌注的改变。