论文部分内容阅读
背景：人体的椎间盘组织(Intervertebral Disc, IVD)大约从20左右岁开始发生退变,椎间盘退变(Intervertebral Disc Degeneration, IVDD)与退行性椎管狭窄、退变性椎体滑脱、颈肩痛及下腰痛(Low Back Pain, LBP)都有密切的关系。引起椎间盘退变的具体因素目前还不十分清楚,目前认为椎间盘的退变是由一系列的因素而引发的,首先发生椎间盘细胞的合成减少和促进细胞凋亡的增加,进而引起细胞外基质表达减少,最终椎间盘的生物学机制和特性发生改变。随着细胞和分子物技术的不断进步,椎间盘细胞的凋亡机制成为一个研究的热点,研究发现椎间盘细胞过度的凋亡和细胞外基质表达的减少成为诱发椎间盘退变的主要原因,EMP-1和Caspase家族高表达起着重要的作用,但是何种因素会导致它们表达增高,目前还不是很清楚。目的：1、研究TNF-α诱导大鼠髓核细胞凋亡的剂量和时间相关性；2、观察大鼠髓核细胞在凋亡过程中EMP-1、caspase-3基因表达变化,探讨TNF-α诱导髓核细胞凋亡相关基因表达的机制。方法：1、获取SD大鼠椎间盘组织,分离、培养单个髓核细胞并进行接种培养,在髓核细胞生长过程中,定期观察细胞形态及生长状况；2、设置：对照组、TNF-α100ng/ml、 TNF-α500ng/ml、TNF-α1000ng/ml作用细胞24h,构建髓核细胞凋亡模型,免疫组织化学法检测各组EMP-1表达的变化；3、设立对照组、不同浓度TNF-α凋亡组：100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml,作用12h,筛选TNF-α最佳作用浓度；4、设立对照组、TNF-α浓度为500ng/ml分别作用6h、12h、24h, RT-PCR检测EMP-1、Caspase3mRNA表达量；5、设立对照组和TNF-α浓度500ng/ml、1000ng/ml作用12h,流式细胞仪上机,检测髓核细胞凋亡情况结果：1、倒置显微镜观察,细胞贴壁生长,呈梭形、不规则形,细胞核透亮,传代后细胞生长加快；2、凋亡细胞模型组中,EMP-1免疫组化染色可见胞浆和胞核内有棕黄色深染的颗粒集聚,与对照组相比,实验组较为明显；3、纤MTT证实：不同浓度TNF-α均可诱导髓核细胞凋亡,当浓度为500ng/ml时凋亡比例最高;4、TNF-α浓度为500ng/ml时,EMP-1、Caspase3mRNA表达量明显增高,差异有统计学意义,作用12h时最高；5、通过流式细胞仪检测TNF-α能够诱导髓核细胞过度凋亡结论：1、TNF-α诱导髓核细胞凋亡存在剂量和时间相关性；2、TNF-α作用髓核细胞能够促进EMP-1、Caspase-3mRNA的表达增高,炎症因子是导致EMP-1表达增高原因之一