论文部分内容阅读
IL-35是新近发现的免疫抑制性细胞因子，由EB13和p35亚基组成。已报道鼠调节性T细胞（RegulatoryT cells，Treg）和经抗原刺激的人Treg均能分泌IL-35，但未经抗原刺激的人Treg却不能分泌IL-35。最近有学者发现B细胞亦能分泌IL-35。IL-35可负向调节免疫功能，在维持机体内环境免疫平衡和免疫性/炎症性疾病发生发展中发挥着重要作用，但其在结核病中的作用尚未见报道。本研究以活动性肺结核患者（Active pulmonary tuberculosis，APTB）为研究对象，采用ELISA、实时荧光定量PCR和流式细胞术检测IL-35在活动性肺结核患者血浆中的水平及其在不同种类白细胞中的表达，分析抗结核治疗对其的影响，并探讨其临床意义，从而为结核病的预防、诊断及临床治疗提供理论依据。 [目的] 检测IL-35在活动性肺结核患者血浆中的含量及其在外周血不同种类白细胞中的表达情况并探讨其临床意义。 [方法] 1.研究对象:按临床诊断标准选择活动性肺结核患者作为研究对象，并根据不同临床资料对患者进行分组，如抗结核药物(Antituberculosis drugs，ATDs)治疗前/后，痰涂片结核分枝杆菌阳性/阴性，患者性别等。采用健康志愿者(Healthyvolunteers，HV)作为对照。 2.样本收集和处理:采用EDTA-K2抗凝，收集活动性肺结核患者入院治疗前和治疗后空腹血样，健康志愿者体检时空腹血样，分离血浆并采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞。 3.血浆IL-35水平的检测:采用人IL-35 ELISA检测试剂盒，检测血浆IL-35含量。 4.IL-35亚基mRNA的检测:提取活动性肺结核患者和正常人外周血白细胞及外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)总RNA，经逆转录后，采用实时荧光定量PCR检测IL-35的两个亚基p35和EBI3 mRNA的表达情况。 5.IL-35在不同类型淋巴细胞中的表达:分离活动性肺结核患者和正常人外周血PBMC，采用多色荧光抗体结合流式细胞术检测并分析样本中IL-35两个亚基p35和EBI3在活动性肺结核患者外周血T细胞及其亚群，以及在B细胞中的表达，并结合临床资料分析其临床意义。 [结果] 1.ELISA检测结果显示:活动性肺结核患者血浆IL-35高于健康对照组，治疗后组低于治疗前组，痰涂结核分枝杆菌阳性（痰涂阳性）患者组高于痰涂阴性患者组。 2.Real time PCR检测结果显示:活动性肺结核患者外周血总白细胞及外周血单个核细胞中p35与EBI3的mRNA表达均高于健康对照组，且EBI3 mRNA在外周血总白细胞中表达高于其在PBMC中的表达。此外，活动性肺结核患者外周血总白细胞中治疗后组p35 mRNA表达低于治疗前组，痰涂阳性患者组高于痰涂阴性患者组;PBMC中治疗后组EBI3 mRNA表达低于治疗前组，p35和EBI3 mRNA表达痰涂阳性患者组均高于痰涂阴性患者组。 3.流式细胞术检测结果显示:活动性肺结核患者外周血p35+CD4+T细胞和EBI3+CD4+T细胞比例均高于健康对照组，且两者在活动性肺结核患者中呈正相关，在健康志愿者中未发现明显相关。痰涂阳性患者p35+CD4+T细胞比例高于痰涂阴性患者，治疗后组低于治疗前组。此外，活动性肺结核患者p35+CD4+CD25+T细胞和EBI3+CD4+CD25+T细胞比例均高于健康对照组，两者在活动性肺结核患者中呈正相关。活动性肺结核患者中痰涂阳性患者p35+CD4+CD25+T细胞比例和EBI3+CD4+CD25+T细胞比例均高于痰涂阴性患者组，治疗后组EBI3+CD4+CD25+T细胞比例低于治疗前组;但几乎没有检测到同时表达p35和EBI3的CD4+CD25+T细胞。 流式细胞术检测结果还显示:体外经BCG刺激后，活动性肺结核患者外周血单个核细胞中p35+CD19+B细胞、EBI3+CD19+B细胞及p35+EBI3+CD19+B细胞比例均明显上调，且痰涂阳性患者EBI3+CD19+B/p35+EBI3+CD19+B细胞比例分别高于痰涂阴性患者，治疗后组分别低于治疗前组。 [结论] 1.活动性肺结核患者血浆IL-35含量升高，治疗后下降，痰涂阳性患者显著高于痰涂阴性患者，且IL-35两个亚基p35和EBI3 mRNA在活动性肺结核患者外周血白细胞中的表达均显著升高，提示IL-35可能与活动性肺结核患者免疫功能障碍有关。 2.p35和EBI3单亚基在活动性肺结核患者T细胞及CD4+CD25+T亚群的表达均升高，且两者的表达存在正相关，提示IL-35及其亚基可能参与T细胞介导的抗结核细胞免疫调节。但由于几乎没有检测到同时表达IL-35两个亚基的T细胞及T细胞亚群，提示T细胞及其亚群有可能不是活动性肺结核患者外周血IL-35的主要来源。 3.BCG刺激可显著上调IL-35及其两个亚基在B细胞中的表达，且痰涂阳性患者高于痰涂阴性患者，治疗后组低于治疗前组，提示活动性肺结核患者外周血中可能存在一群对结核特异性抗原刺激产生反应的分泌IL-35的B细胞亚群，其可能是一群新型调节性B细胞(RegulatoryB cell，Breg)，在机体抗结核免疫调节中可能发挥重要作用。