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本文以鲑鱼降钙素转基因油菜为试材,对转基因油菜油体中表达的目的蛋白进行了分子检测和抗病性研究,目的在于:(1)检测鲑鱼降钙素基因是否整合到油菜基因组中,在油菜油体中是否表达,明确其表达量;(2)初步研究鲑鱼降钙素外源基因的导入对油菜抗病性的影响。(3)克隆可使降钙素酰胺化的大鼠酰胺化酶基因,提高降钙素在植物中的生物学活性;(4)构建大鼠酰胺化酶的植物油体表达载体,探讨其在植物油体表达体系中的表达情况。
具体研究内容和结果如下:(1)通过PCR、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western分析对鲑鱼降钙素的转基因油菜株系进行了分子检测,证明鲑鱼降钙素基因已整合到油菜基因组中并在油菜油体中表达。(2)利用凝胶成像中的定量分析软件,对转基因油菜中oleosin-msCT融合蛋白的表达进行了定量。结果发现:不同转基因油菜株系中目的蛋白的表达量差异很大,融合蛋白表达量占种子总重量从1.04‰到23.78‰不等。其中株系L45和L49中msCT表达量最高,分别占种子总重量的2.96‰和3.96‰。(3)对鲑鱼降钙素转基因油菜的抗病性研究发现:接种油菜菌核病和油菜芜菁花叶病毒后,转基因植株的抗病性较非转基因略好,过氧化物酶、过氧化氢酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶等防御酶系的活性也较非转基因略高。外源基因的导入对提高植物的抗病性可能有一定作用。(4)分离和克隆了拟南芥油体蛋白基因的启动子及编码大豆24KD油体蛋白的结构基因;克隆了大鼠酰胺化酶氧化酶基因,将其插在大豆24KD油体蛋白基因的C端,构建了以拟南芥油体蛋白基因启动子驱动的大豆油体蛋白-大鼠酰胺化酶氧化酶融合蛋白植物表达载体。大鼠酰胺化酶氧化酶基因在植物中的表达未见报道。
本论文的创新点是:(1)明确了鲑鱼降钙素在植物油体体系中的表达情况,筛选得到了msCT高表达的转基因油菜纯系。(2)发现鲑鱼降钙素外源基因整合到油菜基因组后对提高植物的抗病性有一定作用。(3)构建了大鼠酰胺化酶氧化酶植物油体表达载体,首次利用植物油体表达体系表达大鼠酰胺化酶。(4)明确了msCT-大鼠酰胺化酶双价植物油体表达载体的构建策略。