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P53(protein53)是1979年发现的与SV40(simian vacuolating virus40)大T抗原相互作用的蛋白,具有抑制肿瘤发生的作用[1]。其家族成员有p53、p73。1998年,p63作为新的p53家族成员被证明[2]。它与p53结构非常相似,推测p63在人类肿瘤中可能起着与p53相似的作用[3-6]。全长p63可与经典p53 DNA结合位点结合并激活p53相关启动子,如p21、HDM2(Human double mimute2)、Bax(Bcl2-associated X protein)等,提示p63可能参与调控p53的稳定性和凋亡的功能[7,8]。而在生长发育方面,p63基因缺失的小鼠表现为外胚层发育障碍而非肿瘤易感倾向。p63活性的发挥与调节依赖于与其它蛋白质的相互作用[9],这些与p63结合的蛋白质被称为p63共调节因子,研究这些共调节因子有助于深入阐明p63的功能。在实验室前期工作中,以TAp63α为诱饵质粒,利用酵母双杂交技术从乳腺cDNA文库[10]筛选出 p63和新蛋白NipSnap同源物3A(protein NipSnap homolog3A,NIPSNAP3A)有相互作用。 NIPSNAP3A是近年来新发现的功能尚未明确的蛋白,它是NIPSNAP家族成员之一,它在多种组织细胞,如肾上腺、乳腺、肝脏、骨骼肌、子宫颈以及心肌[11]等中表达。对于NIPSNAP家族成员的研究工作较少,通过基因序列比对,发现与组成细胞囊泡的蛋白有较高同源性[12],因此推测它们可能在细胞囊泡运输中发挥作用。但NIPSNAP3A与p63的相互作用有待进一步验证,这种相互作用的生物学功能及机制都有待探讨。于是展开以下实验。 首先回转验证TAp63α-ST与NIPSNAP3A的相互作用,构建相关表达载体,通过GST(Glutathione S-Transferase)pull down及免疫共沉淀实验证实了NIPSNAP3A和p63有相互作用,而与p53和p73没有相互作用,并且通过GST pull down实验确定相互作用区域。发现NIPSNAP3A上的1-144AA区域与p63发生相互作用;p63上TA(transactivation domain)domain与NIPSNAP3A有相互作用。其次,通过转录活性实验发现,过表达NIPSNAP3A会抑制p63介导的p21和HDM2的转录活性,其中对HDM2的影响更明显,并且有剂量依赖效应。而在敲低NIPSNAP3A的情况下,其对P63靶基因转录活性的降低会减弱。最后,通过EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)和ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)实验进一步证实了NIPSNAP3A与p63的相互作用,并且这种相互作用可以抑制p63与下游启动子的结合。 总之,筛选到的NIPSNAP3A与p63相互作用能够影响p63的下游信号分子的转录活性,同时也影响 p63与启动子的结合。这可能影响肿瘤细胞生物学行为。对于阐明p63的调控机制、加深对整个p53家族的了解以及对肿瘤基因治疗和抗肿瘤药物的开发具有重要的意义。