[研究背景与目的]肿瘤细胞无论在缺氧还是有氧的环境下,都主要通过糖酵解途径进行代谢供能,这就是所谓的肿瘤有氧糖酵解,即著名的“瓦博格效应”。大量研究证实,肿瘤细胞的瓦博格效应与糖酵解途径中关键酶的异常活化密切相关,其中丙酮酸激酶(PK)是糖酵解途径中最容易发生异常的关键酶之一。现代研究证实肿瘤细胞中主要表达2型丙酮酸激酶(PKM2),其过度活化促进肿瘤糖酵解及肿瘤增殖与转移。已有研究显示,黑色素瘤具有高度活跃的糖酵解活性,且PKM2的高表达与黑色素瘤转移及预后差关系密切,提示PKM2可能是抑制黑色素瘤生长与转移的潜在靶点。6-姜烯酚(6-Shogaol,6-SHO)是中药干姜中的一种烷基酚类化合物,是干姜中最主要的活性成分之一,实验室前期研究发现,6-姜烯酚能抑制黑色素瘤细胞的增殖,且对黑色素瘤细胞糖酵解过程具有一定抑制效应,因此,我们根据这个现象进行了深入探讨,6-姜烯酚是否能够通过抑制黑色素瘤细胞的糖酵解从而抑制了黑色素瘤细胞的增殖与转移,以进一步揭示6-姜烯酚抗黑色素瘤的分子机制。[实验内容]本研究第一部分从体外细胞水平,应用MTT、划痕、transwell实验考察了6-姜烯酚对黑色素瘤细胞生物学行为的影响。第二部分首先通过MTT实验、葡萄糖摄取、乳酸生成实验考察了黑色素瘤细胞与正常皮肤细胞对糖酵解抑制剂与氧化磷酸化抑制剂的敏感性以及糖酵解水平,初步判断黑色素瘤的代谢表型；接着考察了6-姜烯酚对黑色素瘤细胞糖酵解水平的影响；同时应用酶活实验考察了6-姜烯酚对黑色素瘤糖酵解过程中关键限速酶以及代谢产物的影响。第三部分重点探讨了6-姜烯酚调控2型丙酮酸激酶的机制研究,考察了6-姜烯酚对PKM2蛋白水平以及核转位的影响,同时考察了6-姜烯酚对PKM2核内调控蛋白STAT3蛋白表达以及核转位的影响,并对STAT3下游靶蛋白Cyclin D1、Bcl-xL、MMP-2、MMP-9等表达进行了验证。第四部分分别从转移瘤、皮下移植瘤两种模型考察6-姜烯酚对黑色素瘤体内生长与转移的影响,并通过HE、免疫组化考察6-姜烯酚对转移瘤与移植瘤中PKM2、p-STAT3表达的影响,进一步验证6-姜烯酚的抗黑色素瘤增殖与转移的效应机制。[研究结果]第一部分结果显示,6-姜烯酚能剂量依赖性、时间依赖性的抑制黑色素瘤细胞(B16F10、A375)的增殖；并能一定程度上抑制黑色素瘤细胞的迁移与侵袭,初步表明了6-姜烯酚对黑色素瘤增殖、迁移与侵袭的具有抑制效应。第二部分结果显示黑色素瘤细胞对糖酵解抑制比较敏感,对氧化磷酸化抑制剂不敏感,且糖酵解水平显著高于正常皮肤细胞,初步提示黑色素瘤细胞是偏糖酵解的代谢表型。应用6-姜烯酚干预后,发现6-姜烯酚能抑制黑色素瘤细胞的糖酵解水平(葡萄糖摄取、乳酸生成),同时酶活实验发现6-姜烯酚对糖酵解途径中丙酮酸激酶具有一定抑制效应。第三部分结果显示,黑色素瘤细胞中PKM2表达显著高于正常皮肤,提示黑色素瘤细胞中PKM2的高度活化。应用6-姜烯酚后,能抑制PKM2的蛋白表达；同时发现6-姜烯酚能逆转PKM2激动剂对黑色素瘤细胞迁移与侵袭的促进效应；且对PKM2核内表达也有抑制效应。进一步实验发现,6-姜烯酚对受PKM2调控的STAT3磷酸化有抑制效应,并能抑制STAT3核内磷酸化水平,对STAT3下游靶蛋白也有抑制效应。第四部分的转移瘤、皮下移植瘤实验结果表明,6-姜烯酚对黑色素瘤生长与转移具有一定的抑制效应,且能抑制转移瘤与皮下移植瘤中的PKM2、p-STAT3的表达。[结论与意义]本课题的实验结果表明,干姜中的主要活性物质6-姜烯酚能通过抑制肿瘤糖酵解途径中的PKM2,下调黑色素瘤细胞的糖酵解进程,抑制黑色素瘤的增殖与迁移；同时6-姜烯酚能抑制黑色素瘤细胞中的STAT3活化,并且通过抑制PKM2的核转位,进一步下调核内STAT3的活化程度,从而抑制了黑色素瘤细胞的迁移与侵袭,发挥其抗黑色素瘤增殖与转移的效应。本研究首次揭示了6-姜烯酚抗黑色素瘤增殖与转移的效应,并初步从干扰黑色素瘤糖酵解层面阐述了6-姜烯酚抗黑色素瘤增殖与转移的作用机理。同时也为研究中药,尤其是药食同源类中药发挥其抗肿瘤效应提供了一个新的研究思路与切入点。