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食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率占全球肿瘤发病率的第八位,死亡率占癌症相关死亡率的第六位。我国食管癌发病率占世界首位,是食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)高发地区,约占全球范围内的70%。近年来,其发病率虽有所下降,但ESCC的长期预后仍然较差,术后五年生存率只有15%～25%。DNA甲基化异常改变被认为是ESCC发生发展的常见分子机制之一,主要特征是全基因组低甲基化和位点特异CpG岛高甲基化。进一步了解DNA异常甲基化如何调控ESCC的发生与发展,寻找ESCC甲基化异常改变分子标志物,在指导人们对ESCC患者预后判断以及制定有效治疗方案等方面具有重要临床意义。在本文的第一部分研究中,我们用简化的、具有代表性的DNA甲基化测序(RRBS)及基因表达谱芯片高通量分析技术分析了7例ESCC患者癌及其癌旁组织DNA甲基化水平和mRNA表达水平。先对ESCC和其癌旁差异甲基化基因进行功能富集分析,差异基因主要功能富集在分子连接与调节、细胞组成与调节、催化活性与代谢调节等。另外,细胞运动、物质运输以及细胞间相互作用相关基因发生较大改变。接着,结合前期表达谱芯片结果,筛出位于启动子区DNA甲基化与基因表达水平呈负相关基因。为了筛选ESCC发生发展过程中特异的甲基化改变基因,挑选前10个具有显著差异的基因,结合功能和文献检索,筛选出甲基化升高同时表达降低基因Cyclin Y-like l(CCNYL1)进行后续研究,经过癌症基因组图谱数据库(TCGA)预测获得其在ESCC中未有突变、缺失和扩增等改变。进一步我们用硫化测序PCR(BSP)技术在17对ESCC组织中验证DNA甲基化水平和Real-time PCR技术在10对冰冻ESCC组织中验证mRNA表达水平,结果与RRBS和表达谱芯片结果一致,CCNYL1在ESCC组织中呈高甲基化低表达。经统计学分析,在ESCC中CCNYL1基因DMR处CpG位点13、CpG位点16、CpG位点17、CpG位点18和CpG位点19呈现高甲基化。与人食管上皮永生化细胞株相比,CCNYL1在ESCC细胞株中DNA甲基化水平显著升高,mRNA表达水平降低。然后,通过体外实验在ESCC细胞株中过表达CCNYL1基因,结果显示其对癌细胞增殖有抑制作用。最后,我们采用表观遗传治疗法,经5-杂氮脱氧胞苷(5-aza-dC)处理ESCC细胞株后,CCNYL1基因启动子区DNA甲基化水平降低,而mRNA表达升高,说明甲基化直接调节CCNYL1的表达。另外DMR中CpG位点13、16、17和19甲基化水平显著降低,为肿瘤治疗提供分子基础。所以,CCNYL1基因高甲基化可能参与ESCC的发生,其DMR可能为肿瘤治疗提供新靶点。在本文第二部分的研究中,筛选前期高通量分析获得ESCC淋巴结转移和无淋巴结转移组中甲基化程度与表达水平负相关基因,DMR位于启动子区的差异基因共5个,其中ODC1已在食管癌中有报道,PHB2、 PCMT1、 ARHGEF4在癌症中也有许多研究,只有HSD11B1L研究较少,本部分重点研究HSD11B1L在ESCC发生发展中作用。经验证HSD11B1L在ESCC组织及细胞株中DNA甲基化水平下降(P<0.001),与mRNA表达成负相关,并且在淋巴结转移的ESCC组织中,其甲基化水平低于无淋巴结转移的组织(P<0.001)。另外,在ESCC细胞株中,敲降HSD11B1L影响其恶性程度,能抑制细胞的增殖和侵袭能力。为探索HSD11B1L甲基化频率与临床病理参数之间的相关性,另外增加20例淋巴结转移和20例无淋巴结转移的石蜡包埋ESCC组织用BSP检测HSD11B1L甲基化水平,结果表明,HSD11B1L在淋巴结转移的组织中甲基化水平低(P<0.001),提示HSD11B1L甲基化水平低的患者更容易发生转移。在癌组织中HSD11B1L的甲基化水平与肿瘤分化程度和淋巴结转移有关联性(P=0.039,P=0.004)。将ESCC组织进行Kaplan-Meier生存分析,得到的结果是HSD11B1L异常低甲基化的ESCC病人预后较差(P=0.003),多变量Cox回归生存模型分析结果显示HSD11B1L的甲基化是ESCC病人的一个独立的预后因素(P=0.01)。所以,HSD11B1L异常低甲基化在ESCC发生发展中发挥重要作用,是一个独立的预后因素。