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硅藻是一类分布广泛的光合自养单细胞藻类,是生物硅的最大贡献者。其精美、独特的硅质化的细胞壁是硅藻的主要特征,并作为种的形态学分类特征被精确地一代代地复制着。研究硅藻是如何形成如此形态各异的硅质化结构对揭示硅藻成功的生态学地位,以及深入理解硅元素在生物地球化学循环中的作用具有重要的意义。正因如此,硅藻硅质化结构的形成过程与调控机理研究就引起了当今许多学者们极大的兴趣。
本论文以中心纲硅藻假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana CCMP1335)为研究对象,采用硅限制方法进行同步化培养;通过流式细胞仪的DNA含量测定和荧光显微镜观测确定硅质细胞壁的形成过程及其对应的细胞周期;从同步化培养的假微型海链藻细胞中提取硅质细胞壁形成过程对应不同关键时间点的细胞总蛋白和总RNA;应用最新发展起来的基于同位素标记相对与绝对定量(iTRAQ)蛋白质组学高通量测定技术和新一代高通量转录组测序技术(RNA-Seq)对所获样品分别在转录组水平和蛋白组水平研究硅吸收与硅质化调控机理。文章主要结果如下:
1)在本实验条件下,硅限制24小时后假微型海链藻细胞周期停滞在G2+M期;重新加硅后细胞开始同步化生长。大部分细胞先合成壳环带,再合成壳面,对应的同步化时间分别为1-4小时和4-5小时。7小时大部分细胞完成分裂。在蛋白组学数据中获得的代表性的细胞周期蛋白的表达模式也能够证实硅限制停滞点为G2+M期。
2)从iTRAQ蛋白质组学研究的同步化0小时、1小时、5小时和7小时样品中总共鉴定匹配得到1,831个蛋白质,其中符合差异表达要求的差异蛋白共有165个。得到了包括细胞周期蛋白,硅转运蛋白,囊泡包被蛋白等与硅代谢和细胞周期紧密相关的蛋白质的表达图谱。其中动物源的信号通路有一定的富集,揭示了硅藻中可能存在的新的信号通路。另外介导色素体分裂的蛋白FtsZ的表达模式数据揭示了假微型海链藻细胞周期中色素体分裂的模式。
3)从RNA-Seq转录组学技术研究的同步化0、2、3、4、4.5、5、7小时样品平均每个样品得到3.50×106 reads。鉴定到的基因囊括了几乎所有假微型海链藻基因。在数据中,动力蛋白(kinesins)在环带形成过程中与环带合成相关基因具有共调控的特性,说明其在环带合成中具有重要的作用。另外壳环带和壳面相关基因在细胞壁形成过程中具有反向调节机制,揭示了假微型海链藻中壳环带和壳面合成可能不能同时进行的特点。
4)对蛋白组学数据和转录组学数据的综合分析发现了硅转运蛋白SIT2在蛋白质水平和mRNA水平都与囊泡运输体系具有紧密联系,其中clathrin作为囊泡包被蛋白的一种可能介导硅质直接向SDV运输。