桂花(Osmanthus fragrans Lour.)根据开花时间分为秋桂与四季桂,四季桂一年内多个季节开花。为了研究四季桂不同季节的成花机制,本文以四季桂品种‘四季桂’、‘日香桂’和‘ZAFU-S1’为研究材料,利用显微解剖和石蜡切片技术,比较分析了三个品种不同季节的花芽分化及开花特性;同时,克隆、分离和比较FT与TFL1基因,并分析不同季节成花过程的表达模式,探讨FT与TFL1与桂花不同季节成花的关系。1.四季桂不同季节花芽分化和开花特性比较:‘四季桂’与‘日香桂’一年能成花3次,分别于3月初、6月上旬和10月底开始进行花芽分化,于4月下旬、8月底和11月底12月初完成花芽分化,分别历时约二个月、二个半月或三个月和一个月。‘ZAFU-S1’则一年成花2次,同样于3月初、6月上旬开始花芽分化,于4月下旬、8月底完成花芽分化。三个品种秋季花的花芽分化和开花过程与秋桂基本相似,而其他季的成花和开花过程明显不同。秋季花的花芽分化经历花序分化期、小花分化期、花萼分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和心皮分化期六个时期,完成分化后需要环境低温才能开花,最终形成的花序为聚伞花序,无总梗,花粉发育正常。‘四季桂’与‘日香桂’10月底分化的花芽在完成分化后随即开花,形成的花序有总梗,且有伸长与未伸长之分,长度分别为0.8±0.11 cm、1.03±0.12 cm和3.5±0.71 cm、2.98±0.41 cm。3月分化的花芽与新梢同时生长发育,分化完成后随即开花。春季和冬季的两次分化形成的均是圆锥状花序,具总梗,花粉均败育。综上表明四季桂不同季节的成花机制存在明显的差异,这其中的机制需要进一步的研究。2.四季桂与秋桂中FT与TFL1同源基因的分离及序列分析:根据桂花转录组数据序列信息,设计FT和TFL1引物,从3个四季桂品种‘四季桂’、‘日香桂’和‘ZAFU-S1’及秋桂品种‘堰虹桂’中分别分离得到一个OfFT的cDNA全长以及两个TFL1同源基因OfTFL1A和OfTFL1B的cDNA全长和DNA全长。经过序列比对发现,桂花FT与TFL1基因序列中包含4个外显子与3个内含子;3个四季桂品种的OfTFL1A、OfTFL1B与秋桂‘堰虹桂’的在DNA水平上同源性分别达到99.3%和97.85%以上,cDNA水平达到99.86%和97.69%以上,OfFT在cDNA水平上与‘堰虹桂’同源性达90.48%以上;3个基因均与秋桂‘堰虹桂’具有相同的功能位点。表明四季桂品种的OfFT、OfTFL1A和OfTFL1B的序列与秋桂并无显著差异。因此排除由于OfFT、OfTFL1A和OfTFL1B序列差异导致多季节成花的因素。3.四季桂中FT与TFL1同源基因的表达分析:利用实时荧光定量PCR技术,以桂花花瓣中表达相对稳定的ACT基因作为内参基因,分析了3种四季桂品种中OfFT、OfTFL1A和OfTFL1B在一年多次成花转变以及花发育整个过程中的表达模式。结果发现OfTFL1A和OfTFL1B抑制桂花的成花转变,冬春两季FT表达量在成花转变前后变化不明显,且花发育过程中表达量低于秋季,表明OfFT主要参与秋季成花转变,而不参与冬春季节成花转变。因此冬春季明显存在不同于秋季的成花途径,可排除开花信号最终作用到FT上的途径,因此可能是赤霉素途径。综上所述,四季桂冬春季节的花发育过程不同于秋季,且形成的花序不同;四季桂的成花基因OfFT、OfTFL1A和OfTFL1B的序列与关键功能位点与秋桂相似;冬春两季FT表达量在成花转变前后变化不明显,且花发育过程中表达量低于秋季,这些结果表明四季桂自身存在不同成花机制以及不同的成花途径。