背景:胰腺癌以恶性程度高、患者预后差著称。近年来,尽管胰腺癌相关研究在多方面取得进展,但患者生存期仍未得到显著改善。诊断发现晚、转移进展快及治疗效果差,是目前胰腺癌的主要问题所在,而对其深层次生物学特性认识的不足更加限制了胰腺癌诊疗手段的发展与进步。二代测序技术的发展壮大促使我们对肿瘤内在的生物学特点有了更深入的了解。通过巨视野切割或筛选及显微切割等技术手段克服间质成分过多的问题后,胰腺癌也积累了许多高质量的基因组学及转录组学测序分析研究。然而,仅仅局限于生物信息学分析和传统的实验模型,难以准确反映肿瘤实际的情况。首先,在胰腺癌细胞内部复杂的信号网络调控下,特定的基因突变或者信号通路改变是否真正为肿瘤所依赖难以明确。其次,基于肿瘤组织样本的分子分型虽然能一定程度加深对胰腺癌生物学特性的认识,但对于进一步挖掘潜在的功能差异及开发相关的治疗靶点并不具有太大的帮助作用。最后,在具体的临床实践中,能否用基因组学或转录组学测序完全反映胰腺癌患者的个体化差异从而指导治疗仍是巨大的疑问。在当代医疗发展的背景下,基于患者的肿瘤个体化研究模型逐渐被重视。类器官模型是其中新兴的热点之一,在对肿瘤个体化特性的保留方面已被多项研究所证实。作为基础研究模型,类器官可以有效取代传统2D细胞系进行具体基因或通路的功能验证,同时类器官模型具有极高的肿瘤细胞纯度,对于探索胰腺癌多层面的分子分型具有独特优势,并可以用于后续的功能差异探究及高通量药物筛选。此外,类器官模型还可以反映患者对临床用药的敏感性。在本研究中,我们尝试构建胰腺类器官库并用于基础及临床前试验。在组织形态学及基因组学水平验证胰腺癌类器官库与原肿瘤组织的一致性,并用于探索转录组学和染色质开放性的分子分型,开发可能有效的靶向药物,论证对患者化疗药物敏感性反映的准确性。第一部分胰腺类器官库的构建与鉴定目的探索及优化胰腺类器官培养基方案,构建包含不同病理亚型的胰腺癌及正常胰腺组织类器官库,并进行组织形态学及基因组学鉴定。方法1.利用手术及穿刺胰腺组织样本进行培养基方案测试及胰腺类器官库构建。2.利用苏木精-伊红染色法及免疫组织化学染色法对胰腺癌类器官、体内移植瘤及原肿瘤组织进行组织形态学鉴定。3.利用基因组学测序鉴定胰腺癌类器官的生物学特性,并与公共数据库中胰腺癌样本及原肿瘤组织的基因组学数据进行对比。结果1.通过对24种预设的培养基方案分别进行胰腺癌组织及正常胰腺组织的类器官培养测试,确定了最合适的培养基成分。2.通过手术及穿刺样本,最终构建83例胰腺癌类器官包含导管腺癌74例、腺鳞癌1例、神经内分泌肿瘤3例、腺泡细胞癌1例及导管内乳头状粘液性肿瘤4例共5种病理亚型和6例正常胰腺组织类器官,胰腺癌类器官的培养成功率为77.6%。3.胰腺癌类器官在形态结构上与体内移植瘤及原肿瘤组织均保持高度的相似性,并且在免疫组织化学染色中维持原肿瘤组织的特性。尤其神经内分泌肿瘤类器官在神经内分泌标志物SYN、CGA上与原肿瘤组织保持一致。4.通过对34例胰腺癌类器官和10例对应肿瘤组织分别进行全基因组测序和全外显子测序,获得了高质量的基因组学测序数据。5.与公共数据库中胰腺癌样本及原肿瘤组织的基因组学数据对比显示,胰腺癌类器官高度保留了胰腺癌的生物学特性,并与原肿瘤组织相一致。结论1.通过探索及优化胰腺类器官培养基成分,构建了包含正常胰腺组织与5种胰腺癌病理亚型(导管腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、腺泡细胞癌及导管内乳头状粘液性肿瘤)的胰腺类器官库。2.胰腺癌类器官在组织形态学水平上与原肿瘤组织特征相一致,并维持在体内移植瘤中。3.胰腺癌类器官在基因组学水平上保留胰腺癌的生物学特性,并与原肿瘤组织高度一致。第二部分利用类器官模型探索胰腺癌转录组学及染色质开放性的分子分型目的利用构建成功的类器官库探索胰腺癌转录组学及染色质开放性的分子分型,并筛选有效的表观遗传学小分子化合物。方法1.利用胰腺癌类器官及正常胰腺组织类器官进行转录组学测序并做分型分析。2.利用胰腺癌类器官及正常胰腺组织类器官进行染色质开放性测序并做分型分析。3.利用胰腺癌类器官进行表观遗传学小分子化合物库筛选,并结合染色质开放性分型进行分析。结果1.通过对43例胰腺癌类器官及3例正常胰腺组织类器官高质量的转录组学测序数据进行分析,将胰腺癌类器官分为4种亚型:经典型、基底样型、经典/祖细胞型及新定义的糖酵解活跃型。2.在TCGA公共数据库中,对新的胰腺癌转录组学分型进行验证显示,184例胰腺癌样本可以按照新转录组学分型的差异表达基因较好地分为4型,其中经典/祖细胞型患者预后最佳,而其余3种亚型包括新定义的糖酵解亚型患者预后均较差。3.通过分析41例胰腺癌类器官及3例正常胰腺组织类器官ATAC测序数据的片段大小、转录起始区开放程度相似性、测序质量控制评分及在公共数据库中染色质状态,证实获得的ATAC测序数据质量较高,可用于后续研究。4.进一步分析ATAC测序数据显示,胰腺癌类器官可以在染色质开放性上分为6个亚型,并各自富集不同的转录因子。5.分析283种表观遗传学小分子化合物在35例胰腺癌类器官初筛结果后,选择59种可能有较好抑制作用的小分子化合物对39例胰腺癌类器官进行复筛。其中发现,部分在染色质开放性分型中富集的转录因子可以作为小分子化合物敏感性的标志物。结论1.胰腺癌类器官在转录组学水平可以分为4种亚型:经典型、基底样型、经典/祖细胞型及糖酵解活跃型。2.胰腺癌类器官转录组学新分型可以在公共数据库中得到验证,生存分显示,经典/祖细胞型患者预后最佳,其余3种均较差。3.胰腺癌类器官在染色质开放性水平可以分为6种亚型,并且各个亚型以富集不同的转录因子为特点。4.胰腺癌类器官染色质开放性亚型可以用于指导靶向转录因子的个体化治疗。第三部分利用类器官模型个体化评估胰腺癌患者化疗药物敏感性目的利用构建成功的类器官库个体化评估胰腺癌患者的化疗药物敏感性,并进行体内验证。方法1.利用胰腺癌类器官进行化疗药物敏感性试验。2.收集对应患者的临床治疗及用药情况。3.结合对应类器官的化疗药物敏感性对患者进行生存分析及药物有效性分析。4.利用小鼠体内移植瘤模型,验证类器官体外化疗药物敏感性。结果1.利用35例胰腺癌类器官对6种化疗药物进行初筛,确定复筛使用的化疗药物及浓度梯度。2.利用39例胰腺癌类器官对5种胰腺癌一线化疗药物进行复筛,并根据剂量效应曲线的曲线下面积将类器官在每种药物中均分为敏感、中间敏感及不敏感三类。3.结合对应的39例胰腺癌患者临床治疗情况,将其分为优先根治性手术联合辅助化疗组(31例)、新辅助治疗组(2例)和优先根治性手术但未进行辅助化疗组(6例)进行后续分析,未行化疗的6例患者不做进一步分析。4.在优先根治性手术联合辅助化疗组中,根据胰腺癌类器官化疗药物敏感性及对应患者实际用药情况,我们将患者分为敏感组、中间敏感组及不敏感,生存分析显示,敏感组患者较中间敏感组及不敏感组患者有显著更长的无复发生存期,并在影像学检查资料中得到证实。5.在新辅助治疗组中,患者DAC-36新辅助治疗失败后从转移灶构建的类器官在化疗药物敏感性测试中表现出对使用过的药物均耐药;而患者DAC-38从穿刺样本构建的类器官在化疗药物敏感性测试中的表现与患者实际用药反应相一致。6.胰腺癌类器官DAC-18、DAC-20和DAC-36在小鼠体内移植瘤化疗药物敏感性实验中表现出与体外完全一致的结果。结论1.类器官模型可以用于准确评估胰腺癌患者化疗药物敏感性,指导术后个体化化疗。2.类器官模型可以用于胰腺癌患者新辅助治疗方案指导及新辅助治疗失败后下一步治疗探索。课题总结:1.本研究通过优化培养基方案,构建了包含正常胰腺组织与5种胰腺癌病理亚型(导管腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、腺泡细胞癌及导管内乳头状粘液性肿瘤)的胰腺类器官库。2.胰腺癌类器官库在组织形态学及基因组学水平上与原肿瘤组织保持高度一致,并保留公共数据库中的胰腺癌特性。3.胰腺癌类器官库在转录组学水平上分为4种亚型:经典型、基底样型、经典/祖细胞型及糖酵解活跃型,并在公共数据库中得到验证。4.胰腺癌类器官库在染色质开放性水平上分为以富集不同转录因子为特点的6种亚型,可以指导靶向转录因子的个体化治疗。5.胰腺癌类器官库可以用于个体化评估患者的化疗药物敏感性,指导术后辅助及新辅助化疗方案。