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岷江百合(Lilium regale Wilson)是我国特有的野生百合种,具有耐干旱、耐盐碱、抗病性强等特点。它除自身的观赏价值外,还具有药用价值,是现代百合抗病育种的重要资源。此外,由于地质灾害、人为采挖、开荒等因素,岷江百合野生资源的分布面积及数量明显减少,已成为濒危物种,因而迫切需要加强对岷江百合抗病分子机制的研究,为百合的抗病育种提供理论基础。在课题组前期对岷江百合转录组测序分析中,已获得多个对外源性茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,Me JA)处理和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)感染作出响应的WRKY转录因子c DNA序列。基于前期的研究,本课题选择其中一个WRKY转录因子基因(LrWRKY3)进行功能分析。以岷江百合c DNA为模板,克隆出一个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为537 bp的LrWRKY3转录因子基因,其编码的蛋白质包含一个高度保守的‘WRKYGQK’七肽序列。通过构建Lr WRK Y3亚细胞定位融合蛋白表达载体,并在洋葱表皮细胞中进行瞬时表达,以分析LrWRKY3在细胞中的定位情况。构建原核表达载体在大肠杆菌中异源表达,获得重组LrWRKY3蛋白用于凝胶阻滞实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA),以验证LrWRKY3的专一性结合位点;并通过酵母单杂交实验来验证转录因子是否具有反式激活作用。构建LrWRKY3植物超表达载体,以获得转基因烟草(Nicotiana tabacum L.cv Xanthi)株系并研究其功能。最后通过酵母双杂交系统从岷江百合c DNA文库中初步筛选出可能与LrWRKY3转录因子互作的蛋白。本论文的研究工作及得到的主要结果如下:1、构建p BIN m-gfp5-ER-Lr WRK Y3亚细胞定位载体,并转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中,用阳性单克隆菌液侵染洋葱表皮细胞,共培养两天后通过激光共聚焦显微镜观察到LrWRKY3-GFP融合蛋白定位于细胞核。2、构建了含有p ET-32(a)-LrWRKY3的原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达。由于重组蛋白为包涵体,通过尿素变性、过Ni-NTA柱纯化、透析袋复性、浓缩获得有活性的可溶蛋白His-LrWRKY3。将重组蛋白进行EMSA实验,结果显示重组蛋白能与含有W-box片段的探针结合。前期获得的Lr PR10启动子具有W-box,从而构建诱饵载体p Ab Ai-PLr PR10和猎物体载p GADT7 AD-LrWRKY3进行酵母单杂交实验,LrWRKY3能与PLr PR10发生互作,具有反式激活作用。3、构建植物超表达载体p CAMBIA2300s-Lr WRK Y3,导入烟草中,经过培养获得T2代转基因烟草,q RT-PCR显示LrWRKY3在转基因烟草株系中稳定表达,叶片和植株接种实验表明转基因烟草对尖孢镰刀菌具有很强抗性。并且在转基因烟草中,通过q RT-PCR检测到与茉莉酸(Jasmonic acid,JA)合成相关以及抗病相关的基因在转录水平上的高表达。4、以岷江百合根为材料,构建符合筛库要求的c DN A文库,并构建p GBK T7-Lr WRK Y3诱饵载体。将文库质粒p GADT7-c DNA转入含有诱饵质粒的AH109酵母菌株中,涂布于SD-Trp/-Leu/-His/-Ade平板筛选互作蛋白。初步筛选出45个可能与LrWRKY3转录因子互作的蛋白,包括与植物中DNA复制、转录、蛋白翻译相关,与植物的生长发育相关,参与光合作用,参与植物抗逆和植物能量代谢的蛋白。为后期深入研究LrWRKY3的功能提供基础资料。核定位的LrWRKY3蛋白特异结合顺式作用元件W-box,LrWRKY3转录因子具有转录活性,并通过JA依赖途径参与岷江百合的防御,激活一系列抗病相关基因的转录,从而提高对尖孢镰刀菌的抗性。通过本研究为将来进一步揭示岷江百合抗病机理奠定基础。