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背景与目的:近年来免疫治疗在肿瘤治疗研究领域中获得了巨大的进步,已经成为肿瘤治疗最受瞩目的领域之一。目前越来越多的研究表明新抗原特异性T细胞是包括免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitors)、肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes,TILs)和 T 细胞受体(T cell receptor,TCR)工程化的免疫细胞等多个免疫治疗策略获得临床响应的基石。伴随着基因组学和生物信息学的发展,使得精准的分析每个患者肿瘤特异性突变所产生的新抗原成为了可能。然而,快速高效的筛选鉴定个体化新抗原仍然充满了困难和挑战;同时,在晚期恶性实体肿瘤中缺乏新抗原鉴定及以新抗原为基础的个体化免疫治疗的系统性评价。本研究中,我们建立了两种高效快速的策略在晚期恶性实体瘤患者中行个体化新抗原鉴定:包括以靶向捕获测序和生物信息学为基础的重头开始合成抗原肽的经典模式;和构建以常见实体瘤中驱动热点突变来源的新抗原肽库为基础的新模式。同时,我们在临床试验中针对以新抗原为基础的个体化免疫治疗进行了疗效和安全性评价。研究方法:本研究中共纳入了 26例晚期恶性实体瘤患者,使用靶向肿瘤相关基因的Panel对患者的肿瘤组织、ctDNA样本,和正常组织行新一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)以获取肿瘤中特异性的体细胞突变信息(somatic mutations)。随后,个体化新抗原的鉴定通过以下不同的策略进行:(1)、经典模式:结合患者高丰度的非同义突变信息和HLA精确分型结果,进行新抗原表位预测,选取高亲和力T细胞表位重头合成抗原肽。(2)、新抗原肽库模式:我们通过系统性的挖掘TCGA和COSMIC数据库,选择常见实体瘤中高频驱动突变基因来源的热点突变(Hotspot mutation),针对中国人常见HLA分型(HLA-A*0201、HLA-A*0203、HLA-A*0206、HLA-A*1101、HLA-A*2402),使用 3 种不同的 T细胞表位预测工具,优选表位肽并预先构建新抗原肽库。基因Panel测序获取的患者热点突变与新抗原肽库中相应的HLA限制性肽相匹配。以上两种途径所候选的抗原肽在体外通过ELISPOT、流式细胞术等技术手段检测其刺激活化T细胞后的IFN-Y和CD137的表达,来鉴定具免疫原性的新抗原;并行抗原特异性杀伤、HLA-肽亲和力等相关免疫指标评估。在临床应用中,通过COBE SpectraTM血液分离系统采集外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),进一步制备树突状细胞(Dentritic cells,DCs)和新抗原反应性 T 细胞(neoantigen reactive T cells,NRTs)。在联合免疫调节性的放化疗后,患者接受负载个体化新抗原的DC疫苗皮下注射和NRT细胞静脉回输,并行疗效和安全性评估。结果:上述测序患者中,有4例患者通过经典模式进行新抗原筛选,其中有3例患者成功鉴定出1～2个新抗原;此外,另有12例患者通过新抗原肽库模式进行抗原筛选,其中6例成功筛选出免疫原性新抗原。针对使用靶向416基因Panel进行测序的17例晚期实体瘤患者进行突变负荷和新抗原负荷评估的结果显示:检出的体细胞非同义突变(错义突变-missense mutation)数目为9～73个,中位突变数目为35个;预测到的HLA Ⅰ类分子限制性新抗原数目范围在8～140个,中位新抗原数目为55个。在临床中,共计6位患者接受了新抗原为基础的个体化免疫治疗,平均每位患者接受约108的DC疫苗和1010以上的混合T淋巴细胞(含有约109的CD8+CD137+的NRTs)。迄今,一例多线治疗失败的转移性胸腺瘤患者免疫治疗后实现了持续已超过10个月的完全缓解(CR);另一例转移胰腺癌患者实现了免疫相关的部分缓解(irPR);其余4例患者长期病情稳定,中位无进展生存时间(mPFS)延长至8.6个月。免疫治疗过程中出现发热和疫苗注射局部皮肤红肿,经对症处理后恢复正常或消退,余未见其他严重不良反应发生。结论:我们构建的驱动热点突变来源的新抗原肽库提供了一个新的快速鉴定个体化新抗原的途径;此外,靶向捕获测序亦有足够的潜力来挖掘肿瘤变异信息和用于个体化新抗原鉴定。联合使用以上不同的新抗原筛选策略可以加速新抗原为基础的转化免疫治疗研究,为精准医疗探索出一个新的突破口。