结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是全球范围内的第三大常见癌症,总发病率约5%,5年生存率在40%~60%,死亡率居所有恶性肿瘤第三位。手术、化疗、放疗和靶向治疗是目前CRC的主要治疗手段。对于部分具有转化治疗指征的晚期或局部晚期CRC患者,以及不能手术或因广泛转移而丧失手术机会的患者,化疗对实现术前转化、降低术后复发和转移风险、改善晚期生存质量以及延长总生存时间(overall survival,OS)尤为重要。以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)为基础的化疗方案经多年的临床应用已被证实可以有效治疗CRC,但原发和继发耐药的存在限制了化疗的疗效,是导致治疗失败及患者死亡的主要原因之一,已成为临床工作中亟需解决的问题。深入阐明CRC治疗过程中5-FU耐药的机制,对于完善耐药理论、改进治疗方案、提高患者生存获益均有重要意义。Micro RNA(mi RNA,mi R)是内源性非编码小分子RNA,以往研究表明其可在转录后水平调控基因的表达,广泛参与肿瘤发生、细胞增殖、侵袭转移和血管生成等。近年来研究发现,mi RNA对化疗药物的敏感性也有调节作用,即可表现为化疗增敏作用,还能促进化疗耐药的产生。本课题组前期研究发现,mi R-149在CRC组织较癌旁正常组织的表达水平明显降低,且与CRC细胞的侵袭和转移密切相关,从而提示mi R-149在CRC恶性生物学特性的调节中可能发挥重要作用,但其是否也参与调控CRC的化疗敏感性仍有待研究。本研究首先检测了人CRC细胞5-FU耐药株和亲本株中mi R-149的表达水平与相应5-FU耐药指数之间的关系,结果发现5-FU耐药细胞株中mi R-149的表达水平明显低于亲本株。进一步,分析CRC患者手术切除癌组织中mi R-149的表达水平与以5-FU为基础的化疗方案临床疗效的关系后发现,化疗相对更为有效的患者,肠癌组织中mi R-149的表达水平较高。以mi R-149模拟物转染5-FU耐药株、以mi R-149抑制物转染5-FU亲本株,则可分别增强或降低细胞对5-FU的敏感性。利用生物信息学软件预测mi R-149的靶基因并通过双荧光素酶报告基因法验证后发现,mi R-149可以直接靶向作用于转录因子人类叉头框蛋白(fork head box M1,Fox M1),且两者表达水平呈负相关。mi R-149模拟物转染人CRC的5-FU耐药细胞株,则能抑制Fox M1的表达。RNA干扰技术沉默耐药细胞中Fox M1的表达,可以模拟mi R-149上调对5-FU药物敏感性的增敏作用。敲减CRC细胞中Fox M1的表达后,利用基因芯片法比较敲减前后的基因表达谱差异,结合基因富集分析方法和高内涵细胞增殖实验(high-content screening,HCS),发现Fox M1的下游基因PHF5A对细胞的增殖功能具有调控作用,进一步实验验证了该基因对细胞周期、凋亡、克隆形成能力、5-FU IC50的影响。以上研究提示:(1)mi R-149能够增加CRC细胞对5-FU的敏感性,其表达水平的下降可能是CRC细胞耐药的原因之一。(2)mi R-149可以通过直接调控Fox M1的表达,参与调节CRC对5-FU的化疗敏感性。(3)PHF5A表达是在转录因子Fox M1下游发挥调节细胞增殖功能的新的基因,既往未见报道,PHF5A水平的增高可能是导致凋亡抵抗和5-FU耐药的分子机制之一。总之,本研究初步揭示了mi R-149/Fox M1通路调节CRC对5-FU药物敏感性的机制,发现了受Fox M1调控并与细胞增殖和凋亡密切相关的基因PHF5A,提示mi R-149和Fox M1可能是CRC治疗的新靶点,从而为提高CRC化疗效果提供了新的研究思路和实验依据。第一部分Micro RNA-149在人结直肠癌中的表达及其对5-FU化疗敏感性的调控作用目的:分析mi R-149在人CRC中的表达及其对5-FU化疗敏感性的调控作用。方法:1、采用MTT法测定人5-FU耐药CRC细胞株HCT-8/5-FU和Lo Vo/5-FU以及和亲本细胞株HCT-8和Lo Vo的5-FU半数抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50)。2、通过q RT-PCR法检测各CRC细胞株中mi R-149的表达水平。3、构建mi R-149模拟型和抑制型寡核苷酸(mi R-149/mimics和anti-mi R-149),分别以mi R-149/mimics转染5-FU耐药细胞HCT-8/5-FU和Lo Vo/5-FU,以anti-mi R-149转染亲本细胞株HCT-8和Lo Vo,对比转染前后mi R-149表达水平的改变和CRC细胞株对5-FU的IC50变化。4、收集24例晚期CRC患者(后期均接受至少4个周期以5-FU为基础的化疗)癌组织标本。以q RT-PCR法检测CRC组织中mi R-149的表达水平。5、依据实体瘤评价标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST)1.1版进行化疗效果评价,疗效指标分为完全缓解(complete response,CR)、部分缓解(partial response,PR)、稳定(stable disease,SD)和进展(progressive disease,PD),并据此将患者分为有效和无效两组。其中,CR、PR、SD视为有效,PD视为无效,最后对比两组患者CRC组织中mi R-149的表达差异。结果:1、体外药敏试验结果显示,5-FU耐药细胞株HCT-8/5-FU(IC50:34.8μg/ml)和Lo Vo/5-FU(IC50:73.7μg/ml)的IC50明显高于亲本株HCT-8(IC50:2.8μg/ml)和Lo Vo(IC50:11.8μg/ml),HCT-8/5-FU和Lo Vo/5-FU的耐药指数分别为13.6和6.3。2、mi R-149在HCT-8/5-FU和Lo Vo/5-FU中的表达水平较亲本株均明显降低(p<0.01)。3、转染mi R-149/mimics后,HCT-8/5-FU和Lo Vo/5-FU细胞mi R-149表达上调并对5-FU敏感性增高。其中,HCT-8/5-FU细胞的5-FUIC50值由34.8μg/ml降至15.5μg/ml,Lo Vo/5-FU细胞的5-FU IC50值由73.7μg/ml降至35.8μg/ml。反之,转染anti-mi R-149后,HCT-8和Lo Vo细胞中mi R-149的表达明显下降,细胞对5-FU耐药性明显增强。其中,HCT-8细胞的5-FU IC50由2.8μg/ml升高至8.45μg/ml,Lo Vo细胞的5-FU IC50由11.8μg/ml升高至21.6μg/ml。4、24例CRC组织标本中,化疗有效组的mi R-149表达水平(n=10,1.45±0.24)明显高于化疗无效组(n=14,0.53±0.15)(p<0.01)。结论:mi R-149的表达水平与CRC细胞对5-FU的敏感性密切相关。上调CRC细胞的mi R-149表达水平,可以增加细胞对5-FU的敏感性;反之,抑制CRC细胞mi R-149的表达,可使细胞对5-FU的耐药性增强。CRC患者对以5-FU为基础的化疗方案的敏感性与组织中mi R-149的表达水平相关,mi R-149水平较高者化疗敏感性高。第二部分Micro RNA-149靶向Fox M1调控结直肠癌5-FU化疗敏感性的机制研究目的:探讨mi R-149对Fox M1的靶向调控作用以及对5-FU化疗敏感性的影响。方法:1、利用Pic Tar、Target Scan、mi Randa等数据库预测mi R-149的靶基因,筛选Fox M1作为研究对象,计算机模拟分析mi R-149与Fox M1基因m RNA 3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)的潜在结合位点。2、构建Fox M1 3’UTR的野生型序列(3’-UTR-wt)和突变序列(3’-UTR-mut),分别重组至荧光素酶报告载体p LUC,通过转染CRC细胞,验证mi R-149与Fox M1的靶向调控关系。3、分别以mi R-149/mimics转染HCT-8/5-FU和Lo Vo/5-FU细胞,以anti-mi R-149转染HCT-8和Lo Vo细胞,通过q RT-PCR和Western blot检测转染前后各CRC细胞株Fox M1 m RNA和蛋白的表达水平变化。4、构建干扰Fox M1表达的小发夹结构RNA(small hairpin RNA,sh RNA)载体(p Sil/sh Fox M1)和对照载体(p Sil/shcontrol),稳定转染HCT-8/5-FU和Lo Vo/5-FU细胞,命名为HCT-8/5-FU/sh Fox M1(或HCT-8/5-FU/shcontrol)和Lo Vo/5-FU/sh Fox M1(或Lo Vo/5-FU/shcontrol),通过q RT-PCR、Western blot验证转染效率,并采用MTT法检测细胞对5-FU的IC50变化。5、通过q RT-PCR检测CRC组织标本中Fox M1 m RNA的表达水平,比较化疗有效组和无效组中国Fox M1的表达差异,并分析Fox M1与mi R-149表达水平的相关性。结果:1、生物信息学分析提示,Fox M1的3’UTR存在mi R-149结合位点(3583~3605bp)。2、双荧光素酶报告基因实验结果显示,转染野生型Fox M1 3’UTR载体(p LUC/Fox M1-3’-UTR-wt)后,HCT-8/5-FU和Lo Vo/5-FU细胞与亲本株相比,荧光素酶活性明显增高(p<0.05);随后,将前述两种荧光素酶报告载体与mi R-149/mimics或anti-mi R-149共转染HCT-8/5-FU细胞,结果显示,共转染p LUC/Fox M1-3’-UTR-wt和mi R-149/mimics之后,荧光素酶活性与对照相比明显降低(p<0.01),但共转染p LUC/Fox M1-3’-UTR-wt和anti-mi R-149之后,荧光素酶活性明显增高(p<0.05);突变型荧光素酶载体与mi R-149/mimics或anti-mi R-149共转染后,荧光素酶活性无明显改变。3、在5-FU耐药细胞HCT-8/5-FU和Lo Vo/5-FU中,Fox M1的m RNA和蛋白表达水平较亲本株增高(p<0.01),转染mi R-149/mimics后,Fox M1 m RNA和蛋白的表达明显降低(p<0.01);以anti-mi R-149转染亲本细胞HCT-8和Lo Vo后,Fox M1 m RNA和蛋白的表达明显增高(p<0.01)。4、以p Sil/sh Fox M1和对照p Sil/shcontrol分别转染HCT-8/5-FU和Lo Vo/5-FU,得到稳定转染的细胞株HCT-8/5-FU/sh Fox M1(或HCT-8/5-FU/shcontrol)和Lo Vo/5-FU/sh Fox M1(或Lo Vo/5-FU/shcontrol)。通过q RT-PCR和Western blot检测发现,与对照相比,HCT-8/5-FU/sh Fox M1和Lo Vo/5-FU/sh Fox M1中Fox M1 m RNA和蛋白的表达明显下调(p<0.01);MTT结果显示,5-FU IC50分别从34.8μg/ml和73.7μg/ml降至10.5μg/ml(p<0.05)和29.4μg/ml(p<0.05)。5、CRC组织标本中,化疗有效组的Fox M1 m RNA表达水平(n=10,1.84±0.12)显著低于化疗无效组(n=14,2.64±0.25)(p<0.05),并且mi R-149与Fox M1 m RNA表达水平呈负相关(n=24,r=-1.52,p<0.01)。结论:Fox M1是mi R-149可直接结合并负向调控的靶基因,在5-FU耐药的CRC组织和细胞中,mi R-149表达较低,Fox M1表达较高,沉默Fox M1可以模拟mi R-149对CRC细胞的化疗增敏作用。mi R-149可能通过抑制Fox M1表达从而影响CRC对5-FU的敏感性。第三部分表达谱芯片筛选Fox M1下游靶基因与验证分析目的:应用RNA干扰和基因芯片技术,比较Fox M1下游基因敲减对5-FU耐药CRC细胞的增殖的影响,初步筛选出Fox M1下游可能参与调控5-FU耐药的基因。方法:1、利用软件设计Fox M1的RNA干扰序列,构建其sh RNA的表达载体转染HCT-8/5-FU细胞,通过q RT-PCR检测目的基因的m RNA表达水平,确认干扰效果。2、抽提Fox M1基因被干扰前后HCT-8/5-FU细胞的总RNA,应用Affymetrix的Gene Chip primeview human基因芯片检测,筛选差异基因。3、应用Pathway富集分析和Gene Ontology分析软件对差异基因进行综合分析。由于Fox M1对下游基因的调节主要是正向作用,从差异基因中筛选Fox M1被干扰后表达明显下调的基因,结合复习文献和检索Gen Bank信息,选取其中可能参与调控细胞增殖和耐药性的基因为待研基因。4、利用HCS筛选的方法,通过比较基因敲减对5-FU耐药细胞的增殖的影响,筛选出增殖抑制表型显著的基因。针对每个基因设计3个RNA干扰靶点,并将携带不同靶点的3个质粒等比例混合进行慢病毒包装,经sh RNA慢病毒感染4天后,细胞铺于96孔板,celigo连续检测5天。5、针对具有增殖抑制作用的基因,进一步通过流式细胞术、细胞克隆形成实验和MTT实验,验证在目的基因被干扰前后细胞增殖、细胞周期、凋亡、克隆形成、5-FU IC50的变化。结果:1、成功构建Fox M1基因的RNA干扰序列。2、基因芯片筛选结果显示,在Fox M1基因被干扰前后,HCT-8/5-FU细胞有显著表达差异的基因共1204个(FC>1.2,p<0.05),其中上调基因数554个,下调基因数650个。3、通过生物信息学分析和文献复习,在表达下调的基因中筛选出25个有潜在增殖抑制功能,但报道较少的基因。经RNA干扰和HCS筛选,获得增殖抑制表型最显著的基因PHF5A。4、通过q RT-PCR和Western blot验证PHF5A干扰效率后,细胞增殖显著抑制,克隆形成能力减弱,处于G1和S期的细胞显著减少,处于G2期的细胞显著增多,细胞凋亡增加,5-FU IC50降低。结论:Fox M1可以通过调控PHF5A基因,导致CRC耐药细胞的周期改变和凋亡减少,降低5-FU敏感性,这提示PHF5A是在Fox M1下游发挥重要调节功能的基因,可能参与由Fox M1介导的耐药表型的形成。