论文部分内容阅读
[目的] (1)克隆人软骨调节素(ChM-Ⅰ)cDNA，并在原核表达系统中表达和纯化。(2)观察ChM-Ⅰ在软骨组织中的表达，探讨软骨中血管生成抑制的机理。(3)在体外研究ChM-Ⅰ对人脐静脉血管内皮细胞(HVEC)的作用。(4)构建裸鼠的骨肉瘤模型，研究ChM-Ⅰ在体内对骨肉瘤血管诱导生成作用的抑制。[方法] (1)利用RT-PCR技术从人软骨组织中扩增出ChM-Ⅰ基因片段，并将其克隆到原核表达载体pET28a中，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG进行诱导表达；对在N末端融合了6×His纯化标签的表达产物进行Western blot分析和用Ni2+2NTA离子交换树脂进行纯化；纯化蛋白进行SDS-PAGE纯度分析。(2)免疫组化法检测ChM-Ⅰ蛋白，原位杂交检测ChM-ⅠmRNA的表达。(3)在体外培养的HVEC中加入纯化的人重组的ChM-Ⅰ，对照组以等量0.01M，pH7.2PBS代替ChM-Ⅰ，传代培养72小时后取贴壁细胞进行研究。(4)在裸鼠皮下注射入骨肉瘤MG-63细胞，成瘤后采用组织悬液的匀浆法和肿瘤块的插块法传代，构建骨肉瘤模型。对骨肉瘤的生长和形态进行观察，采用流式细胞仪对第4代移植瘤进行细胞周期的鉴定。在稳定生长的第4代移植瘤周围注射ChM-Ⅰ进行封闭，裸鼠生长到5周后处死，在光镜下计算移植瘤体极其周围的毛细血管面积密度，与对照组用SPSS统计软件包进行t检验。[结果] (1)获得了人软骨调节素cDNA，并成功构建了高效原核表达质粒pET(ChM-Ⅰ)；Western blot结果表明，在大肠杆菌中表达了分子量约为25kDa的ChM-Ⅰ目的蛋白；表达产物经Ni2+2NTA离子交换树脂纯化，ChM-Ⅰ蛋白的纯度大于90％以上。(2)在免疫组化中静息及增殖软骨区中的软骨基质间区，以及软骨细胞的细胞质中存在强烈的免疫反应信号，用预免疫的兔IgG处理过的阴性对照切片中无阳性染色。原位杂交中发现增殖区软骨细胞的ChM-ⅠmRNA表达水平最高。低肥大区和钙化区的杂交信号亦呈背景水平。(3)与对照组相比，光镜观察可见ChM-Ⅰ组细胞明显拉长，HVEC无法形成血管样结构。(4)获得了稳定迅速生长的裸鼠骨肉瘤模型，经过ChM-Ⅰ封闭注射的移植瘤周围的毛细血管面积密度少于对照组，P＜0.01，有显著的差异。[结论] (1)ChM-Ⅰ基因的克隆与表达及纯化为下一步的后续实验研究其生物活性及应用获得了纯化的ChM-Ⅰ。(2)软骨中的ChM-Ⅰ蛋白存在于软骨基质中，和bFGF蛋白区域清楚地分开，bFGF被ChM-Ⅰ紧紧地包裹在软骨细胞外周，这种唯一的位置关系可以解释ChM-Ⅰ在软骨中抗血管生成的特性。(3)经ChM-Ⅰ作用后血管内皮细胞形态结构发生改变，可以抑制HVEC血管样结构的形成。(4)纯化的ChM-Ⅰ在裸鼠体内可以对骨肉瘤的血管生成抑制，减少血管面积密度，对临床指导治疗骨肉瘤的侵袭转移，提高患者的生存率有积极的意义