论文部分内容阅读
目的：肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)是一种旁腺体分泌多功能多效性的细胞因子,主要在肝脏中产生,通过与c-MET受体结合在肿瘤中发挥多种作用,能增加趋化运动和促进恶性肿瘤的生长。本研究利用抗体工程技术制备HGF鼠单克隆抗体和HGF单链抗体(single chain variable fragment, ScFv),耦合微纳米材料悬臂梁器件,力求开发出肝癌患者早期血清学诊断的有效试剂盒。方法：1.用本课题组表达纯化的融合蛋白HGF免疫Balb/c小鼠,从而得到能分泌HGF的B细胞。2.用细胞融合技术将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0融合,用ELISA法筛选具有分泌功能的单克隆抗体。3.用ELISA法,Western Blotting方法对筛选出的单克隆抗体进行功能性验证,应用HiTrap Protein G HP柱纯化抗体。4.应用夹心ELISA法将HGF单克隆抗体用于HCC患者血清的检测,以及用于悬臂梁纳米器件的连接。5.用PCR法克隆出HGF单抗的重链轻链可变区以及Overlap PCR法连接重链和轻链可变区。6.用重组技术构建Payz-HGF ScFv质粒,在大肠杆菌16C9中大量表达,应用HitrapFF亲和层析柱纯化HGF ScFv抗体。结果：1.HGF融合蛋白的免疫效果良好,血清学效价达到1：16000。2.筛选出3株HGF单克隆抗体,分别是HGF H-1(IgG2b), HGF H-2(IgG2a), HGF H-3(IgG1)。3. HGF H-1(IgG2b), HGF H-2(IgG2a)能很好应用于ELISA和Western Blotting对HGF的检测。制备得到HGF H-1、HGF H-2分别为7mg和8mg。4.用biotin成功标记了HGF H-1,应用夹心法ELISA法检测30例HCC患者血清和30例正常人血清,差异明显。5. HGF H-1成功耦合在悬臂梁纳米器件,初步得出对HGF的检测限为0.76pg。6.构建了Payz-HGF ScFv质粒,表达纯化得到HGF ScFv抗体15mg。结论：1.本研究制备了三株针对细胞因子HGF的鼠单克隆抗体,抗体亚型分别为IgG2a, IgG2b, IgG1。2.本研究初步建立了HGF单克隆抗体夹心法ELISA检测试剂盒,并且将抗体用于微纳米悬臂梁器件的耦合。3.本研究制备了HGF ScFv抗体。