研究背景： 慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia，CML)特征性的细胞遗传学标志是9号和22号染色体易位形成的费城染色体(Ph染色体)。它是c—Abl基因的第一个外显子被bcr基因所替代，产生BCR—ABL癌基因，编码分子量为210 KDa的Bcr—Abl蛋白，后者在CML的发病过程中发挥重要作用。Bcr—Abl蛋白可通过持续激活的酪氨酸激酶活化下游相关的信号转导通路，包括Ras/MAPK、PI3K/AKT、ERK、NF—κB、JAK—STAT通路等，诱导产生不依赖生长因子的细胞增殖，抑制细胞凋亡，导致白血病的产生。 Imatinib mesylate(又称为伊马替尼，ST1571，Gleevec，格列卫)的应用，极大的提高了慢性粒细胞性白血病(CML)的治疗效果，其靶向抑制引起CML的特征性分子—Bcr—Abl酪氨酸激酶，而不影响其他正常的细胞。目前已经成为临床上治疗CML的一线用药。然而，随着Imatinib的应用，耐药和复发成为限制其疗效的主要原因。耐药的主要原因包括：Bcr—Ab1基因的扩增或过表达、点突变，P—gp蛋白表达增高，以及不依赖Bcr—Ab1激酶的耐药机制等。其中Src家族激酶的过表达在不依赖Bcr—Ab1激酶的耐药机制中发挥重要作用。随着分子靶向治疗研究的深入发展，目前普遍认为：同时抑制多个酪氨酸激酶活性的小分子抑制剂可能比单靶点抑制剂的治疗效果更为显著。 ZD6474(ZactimaTM、Vandetanib)是一种苯胺基喹唑啉化合物，为口服的小分子酪氨酸激酶抑制剂，由AstraZeneca制药公司研发。除了抑制VEGFR和EGFR之外，ZD6474还同时抑制多种酪氨酸激酶的活性。临床前实验和Ⅰ期、Ⅱ期临床试验结果证实ZD6474在多种实体瘤(如非小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等)中显示了显著的抗肿瘤活性，口服具有很好的耐受性。目前该药正在进行非小细胞肺癌的Ⅲ期临床试验。有研究证实ZD6474可以抑制EOL-1，MV4-11，Kasumi-1等白血病细胞的增殖，但是还没有关于ZD6474对CML的体外、体内治疗研究。 K562细胞株系人CML急性变期细胞株，既具有急性白血病细胞的特点，又具有CML细胞特有的本质，是体外筛选抗白血病药物、研究其疗效及机制的首选细胞模型。本实验研究ZD6474对体外培养的人类红白血病细胞系K562的杀伤作用，及对其衍牛的Imatinib耐药细胞株K562/G和多药耐药细胞株K562/A的抗增殖作用，探讨其可能存在的分子机制，研究ZD6474的体内抗白血病作用，同时研究了Src激酶在诱导Imatinib耐药中的作用，证实抑制Src激酶可以有效地诱导耐药K562细胞及亲代K562细胞凋亡。 方法： 1.我们通过逐渐增加药物浓度的方法成功诱导Imatinib耐药细胞株K562/G，同样方法用阿霉素诱导多药耐药细胞K562/A。WST方法证实耐药诱导成功，流式细胞仪分析Imatinib对细胞周期的影响。Western blot方法检测耐药株中明显变化的分子。 2.WST法检测ZD6474对K562、K562/G和K562/A细胞活力的影响，流式细胞仪检测ZD6474对细胞周期的影响。 3.采用RT—PCR和Western blot方法分析ZD6474诱导CML细胞凋亡可能存在的分子机制，利用体外重组Src激酶检测ZD6474对Src激酶的直接抑制作用。 4.应用Src激酶特异抑制剂PP2，检测Src激酶在诱导Imatinib耐药中的作用。 5.利用FuGENE()HD转染试剂在K562细胞中瞬时转染携带Src基因的pcDNA3.1(—)质粒，使Src激酶过表达，检测Src激酶过表达对Bcl—2表达的影响，WST法检测过表达Src激酶后，细胞对Imatinib敏感性的变化。通过RNA干扰技术沉默K562/G细胞中Src基因，检测干扰Src激酶表达之后细胞活力的变化。 6.建立K562、K562/G和K562/A细胞的裸鼠皮下移植瘤模型，利用灌胃给药的方式给予ZD6474，连续给药18天，观察移植瘤生长情况，并用免疫组化方法分析肿瘤细胞的增殖和Src激酶的表达情况。 结果： 1.本研究中分别用Imatinib和阿霉素诱导K562细胞，建立了对Imatinib耐药的K562/G细胞株和多药耐药细胞株K562/A。与K562细胞相比，10μM的Imatinib不能抑制K562/G细胞增殖，显示了大于30倍的耐药，K562/A细胞显示了大于3倍的耐药。Imatinib不能诱导K562/G和K562/A细胞阻滞于G0/G1期。Western blot结果表明，K562/G和K562/A细胞中磷酸化Src(p—Src)表达显著升高，同时Bcl—2和p—STAT3的表达也有所增高。 2.ZD6474作用于K562、K562/G和K562/A细胞48小时，其抑制细胞生长增殖的IC50分别为1.61μM、3.18μM和2.47μM。流式细胞仪分析结果显示，ZD6474抑制CML细胞增殖的作用与诱导细胞G0/G1期阻滞有关，6μM ZD6474处理细胞24小时，处于G0/G1期的细胞分别由40.2％、29.9％和25％提高至76.3％、55.2％和54.2％(P<0.05)，伴随处于S期和G2-M期细胞的相应减少。 3.ZD6474呈剂量依赖的方式诱导K562、K562/G和K562/A细胞中PARP蛋白的裂解，证实其可诱导细胞凋亡。体外激酶测定结果表明，ZD6474可以直接抑制Src激酶活性，在转录后水平抑制Src蛋白的表达和磷酸化。ZD6474在抑制Src激酶活性的浓度可以显著诱导CML细胞的凋亡，提示其诱导CML细胞凋亡与抑制Src激酶活性有关。进一步检测发现，ZD6474还通过上调Bcl—2家族中Bax/Bcl—2的比例，以及下调p—STAT3的表达起到促进细胞凋亡的作用。 4.利用Src激酶特异的抑制剂PP2处理K562、K562/G和K562/A细胞24小时，可引起细胞凋亡，下调Bcl—2表达，证实抑制Src激酶可以诱导CML细胞凋亡，下调Bcl—2表达，而PP2对p—STAT3的表达没有影响，推测p—STAT3的激活并非都是由Src激酶所引起。 5.在K562细胞中高表达的Src激酶，可以诱导细胞产生对Imatinib的耐受及上调Bcl—2的表达。而在K562/G中用RNA干扰技术沉默Src激酶，可以抑制47％(24小时)和53％(48小时)的K562/G细胞增殖。 6.以25-100mg/kg/day的ZD6474每日一次口服给药，可以显著抑制K562、K562/G和K562/A裸鼠移植瘤的生长(P<0.05)；肿瘤组织免疫组化分析显示，ZD6474可以抑制肿瘤组织中Src激酶的表达。 结论： 本研究中分别用Imatinib和阿霉素诱导K562细胞，建立了对Imatinib耐药的K562/G细胞株和多药耐药细胞株K562/A。Western blot检测其耐药机制主要与p—Src过度表达，以及Bcl—2和p—STAT3上调有关。ZD6474可以剂量依赖性抑制K562、K562/G和K562/A细胞增殖，其机制与诱导细胞周期阻滞和凋亡有关。进一步探讨分子机制发现，ZD6474诱导凋亡的机制主要是通过抑制Src激酶活性，上调Bax/Bcl—2比例，并抑制p—STAT3活性所致。Src激酶特异抑制剂PP2的应用，证实Src激酶在诱导Imatinib耐药和上调Bcl—2中起重要作用。K562细胞中过表达Src激酶，可以成功诱导K562细胞对Imatinib耐药。用RNA干扰方法抑制K562/G细胞中的Src激酶，可显著抑制K562/G细胞增殖。ZD6474以剂量依赖方式显著抑制K562、K562/G和K562/A裸鼠移植瘤生长，并抑制肿瘤组织中Src激酶的表达。研究结果证实，ZD6474可以有效抑制Imatinib耐药的慢性粒细胞性白血病细胞增殖，诱导凋亡。Src激酶在诱导Imatinib耐药中起着重要作用，可以成为治疗Imatinib耐药的CML病人的有效靶点。本研究为ZD6474在治疗Imatinib耐药的慢性粒细胞性白血病病人中进行临床试验提供可靠的实验依据。