【摘 要】
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白介素-4受体(IL-4R)在实体瘤和血癌等许多肿瘤细胞表面表达量很高,构建导向IL-4R的免疫毒素,是研究肿瘤治疗的一个重要方向.天然IL-4分子N末端和C末端含有很多与受体结合的
【出 处】
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中国科学院研究生院 中国科学院大学
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白介素-4受体(IL-4R)在实体瘤和血癌等许多肿瘤细胞表面表达量很高,构建导向IL-4R的免疫毒素,是研究肿瘤治疗的一个重要方向.天然IL-4分子N末端和C末端含有很多与受体结合的活性位点,为了降低连接蛋白毒素时对这些位点的影响,将天然IL-4分子的N端和C端用寡肽GGNGG相连,并在非活性部位形成新的开口,构建了cpIL-4;为了进一步提高cpIL-4与IL-4R的亲和力,通过重叠PCR引入13位点突变,得到cpIL-4(13D);为了增强IL-4免疫毒素对淋巴细胞的选择性,在121位引入点突变,得到cpIL-4(13D121E).将上述三种重组IL-4分子分别于大肠杆菌表达系统进行表达.ELISA分析表明,三种重组蛋白均可与人IL-4抗体特异性结合.由于PE的DNA序列的GC含量很高,很难用常规手段进行改造,本文采用特殊条件的PCR反应和酶切反应进行绿脓杆菌外毒素PE的改造,得到PE38KDEL,并于大肠杆菌表达系统进行表达.其特点是分子量较小,不含结合区,C末端氨基酸KDEL有利于提高其跨膜能力和细胞毒作用.将靶向分子分别与毒素分子相连,得到三种免疫毒素:cpIL4-PE38KDEL,cpIL4(13D)-PE38KDEL,cpIL4(13D121E)-PE38KDEL.将之分别于表达载体pET-32a(+)进行表达,目的蛋白表达量均约为菌体总蛋白的30％.Western blotting分析表明,诱导后表达的三种IL-4免疫毒素均可与hIL-4抗体特异性结合.采用Ni-NTA亲和层析和阴离子交换层析纯化上述三种IL-4免疫毒素,纯度均在95％以上.用MTT法检测其细胞毒作用,结果显示,免疫毒素cpIL4(13D)-PE38KDEL可特异性地靶向产生IL-4R的细胞株,且其活性与未突变的免疫毒素cpIL4-PE38KDEL相比有2-3倍的提高;免疫毒素cpIL4(13D121E)-PE38KDEL对表达Ⅰ型IL-4R的淋巴瘤细胞结合力较强,对表达Ⅱ型IL-4R的内皮细胞结合力较弱,因此对淋巴瘤具有一定的选择性,这对于提高药物疗效,降低血管渗漏症等毒副作用具有重要意义.
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