研究背景口腔种植是目前修复牙列缺损、缺失最有效的手段之一,已经在临床上得到了广泛的应用。自从1969年Branemark首次将钛种植体成功植入颌骨内,钛金属材料逐渐成为口腔种植修复的主流材料,其特点包括轻质、强度高以及良好的抗疲劳性能。在我国,种植牙也得到了越来越广泛的开展,大部分种植牙获得了良好的功能和美观效果。但是,同时也有数据统计显示,56%的患者和43%的种植体有着不同程度的骨丧失,这意味着种植体存在失败的风险。其中最常见的失败原因在于感染及种植体的表面处理因素。近年来的研究表明,种植体周围炎是导致种植修复失败的重要原因之一。分泌炎症因子的细胞种类很多,如单核细胞、淋巴细胞、脂肪细胞、内皮细胞等,而其中单核细胞是炎症因子最重要的来源。而在炎症因子中,主要有IL-6以及TNF-a等参与炎症过程,与种植体骨界面的骨吸收密切相关。另一方面,种植失败来源于牙膏、漱口液以及饮用水中的氟离子以及体液的腐蚀作用。钛和钛合金种植体表面存在一层钝化膜(Ti02),其在含氟环境下的抗腐蚀能力不足。因此在口腔环境中氟离子可导致该钝化膜的破坏,破坏种植体与骨组织的结合。因此,提高牙种植体的抗腐蚀性能和生物学性能十分重要。深化钛种植体的表面改性研究,使其具备更好的表面及整体性能,能有效缩短临床愈合时间,以达到早期生物稳定并维持功能负重后的长期稳定性的良好效果。钽金属(Ta)材料作为种植体涂层,可增强材料的抗腐蚀性能及耐磨损性能。而Ta具有良好的骨附着性,在骨科领域也有较多的应用。研究目的本研究的目的是对Ta颗粒的生物安全性作初步评价,并进一步探讨Ta颗粒对人单核细胞毒性及分泌炎症细胞因子的影响,从而了解Ta材料作为种植体涂层的应用前景。材料和方法第一部分本研究通过Ta颗粒与人单核细胞(THP-1)共培养,检测该材料的生物安全性及其对人单核细胞细胞因子IL-6、TNF-a分泌的影响。检测Ta颗粒对THP-1的体外细胞毒性(参照ISO10993-5：2009进行试验)：采用THP-1细胞系,使用含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基,在37℃、5%C02的培养箱中进行细胞的培养与传代,取对数期生长状态良好的细胞,制备细胞悬液。通过细胞计数方法,控制细胞密度在1×104/ml,将细胞接种于96孔培养板中(100μL/孔)。将培养板置于培养箱中预培养24h后,按照实验分组方法分别将相应实验材料加入到各组细胞悬液中。实验分组如下：空白组：不含细胞和样品的培养液,仅用于计算细胞存活率；阴性对照组：含有THP-1细胞及培养液,不含样品；阳性对照组：含有THP-1细胞及0.64%苯酚的低糖DMEM培养液(单独设置培养板,防止苯酚挥发影响实验组)；HA颗粒组：含有THP-1细胞、培养液及HA颗粒(SAR=10：1)；Ta颗粒组：含有THP-1细胞、培养液及Ta颗粒(SAR=10：1)。按照3个时间点(24h、48h、72h)每组设置3块平行板,每组样本量为15。在以上三个时间点进行体外细胞毒性检测。向各组样本中加入CCK-8试剂(10μL/孔),将96孔培养板置于培养箱内孵育2h,使用酶标仪测定在450nm处的OD值。第二部分检测Ta颗粒对THP-1细胞凋亡的影响：THP-1细胞培养同第一部分。取对数期生长状态良好的细胞,将细胞接种于6孔培养板中。将培养板置于培养箱中预培养24h后,按照实验分组方法分别往阴性对照组及实验组细胞悬液中加入相应实验材料。实验分组如下：阴性对照组：含有THP-1细胞及培养液,不含样品；阳性对照组：含有THP-1细胞及脂多糖(LPS)(选取浓度为500ng/m1)的低糖DMEM培养液(单独设置培养板,防止影响实验组)；HA颗粒组：含有THP-1细胞、培养液及HA颗粒(SAR=10：1)；Ta颗粒组：含有THP-1细胞、培养液及Ta颗粒(SAR=10：1)。按照3个时间点(24h、48h、72h)每组设置3块平行板,样本量为15。实验材料与THP-1细胞共培养时间结束后,显微镜下观察THP-1细胞形态并拍照。离心(2000rpm,5mmin)收集细胞,PBS洗涤细胞二次,收集1-5x105细胞。加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞后,分别加入5μlAnnexin V-FITC及PI混匀,室温避光反应10min。1h内上流式细胞仪检测THP-1细胞凋亡情况。第三部分检测Ta颗粒对THP-1分泌炎症因子的影响：THP-1细胞培养及实验干预同第一部分。实验分组如下：阴性对照组：具有培养基、THP-1细胞；阳性对照组：含有THP-1细胞及LPS(选取浓度为300ng/m1)的低糖DMEM培养液(单独培养,防止影响实验组)；HA颗粒组：具有培养基、THP-1细胞和HA颗粒(SAR=10：1)；Ta颗粒组：具有培养基、THP-1细胞和Ta颗粒(SAR=10：1)。样本量为15,实验材料与细胞共培养时间选择24h、48h和72h。应用实时荧光定量PCR测定各组细胞IL-6、TNF-a的表达水平。统计学分析本研究采用SPSS13.0软件,通过析因方差分析进行统计分析。检验水准a=0.05,P<0.05表示差异有统计学意义,P>0.05表示差异无统计学意义。结果1.体外细胞毒性实验中,样品与细胞共培养24h后检测各组OD值分别为：阴性对照组为1.086±0.095；阳性对照组为0.342±0.033；Ta颗粒组为1.041±±0.090；HA颗粒组为1.053±±0.088。阴性对照组与Ta颗粒组、HA颗粒组间差异无统计学意义(P>0.05),阳性对照组与阴性对照组、Ta颗粒组、HA颗粒组间差异有统计学意义(P<0.05)。样品与细胞共培养48h后检测各组OD值分别为：阴性对照组为1.198±±0.118；阳性对照组为0.328±±0.034;Ta颗粒组为1.132±±0.122；HA颗粒组为1.129±0.113。阴性对照组与Ta颗粒组、HA颗粒组问差异无统计学意义(P>0.05),阳性对照组与阴性对照组、Ta颗粒组、HA颗粒组间差异有统计学意义(P<0.05)。样品与细胞共培养72h后检测各组OD值分别为：阴性对照组为1.393±±0.078；阳性对照组为0.322±±0.019；Ta颗粒组为1.312±±0.070；HA颗粒组为1.309±±0.068。阴性对照组与Ta颗粒组、HA颗粒组间差异无统计学意义(P>0.05),阳性对照组与阴性对照组、Ta颗粒组、HA颗粒组间差异有统计学意义(P<0.05)。此外,同种处理方法随着共培养时间的延长,各组的OD值呈增加趋势,且差异有统计学意义(P<0.05)。体外细胞毒性检测结果表明Ta颗粒与THP-1共同培养,24h、48h及72h均无明显的细胞毒性(P<0.05)。2.流式细胞术检测细胞凋亡实验中,流式细胞仪检测散点图结果显示,各组坏死细胞在细胞总数中所占比例极小。而阳性对照组出现大量的凋亡细胞。阴性对照组、HA颗粒组以及Ta颗粒组以正常活细胞为主,同时可见少量凋亡细胞。随着培养时间的延长,凋亡细胞数量逐渐增多。Annexin V-FITC/PI染色显示：阴性对照组24h、48h及72h总的细胞凋亡率分别为8.7±0.8%、9.1±0.9%及15.0±0.8%；阳性对照组24h、48h及72h总的细胞凋亡率分别为48.4±3.8%、48.9±4.8%及49.2±3.0%；Ta颗粒组24h、48h及72h总的细胞凋亡率分别为10.0±0.9%、10.6±1.1%及22.1±1.2%；HA颗粒组24h、48h及72h总的细胞凋亡率分别为9.7±0.9%、10.1±0.8%及21.3±1.0%。各组细胞凋亡率随时间的延长而呈现增高趋势。阳性对照组的细胞凋亡率虽然随着培养时间延长而有所增高,但是各培养时间细胞凋亡率的差异无统计学意义(P>0.05)。除阳性对照组外,其余各组培养24h与48h的样本间差异均无统计学意义(P>0.05),而培养72h与两者间差异有统计学意义(P<0.05)。培养72小时的样本中,Ta颗粒组及HA颗粒组细胞凋亡率明显高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05),但是Ta颗粒组的细胞凋亡率与HA颗粒组间差异无统计学意义(P>0.05)。3.实时荧光定量PCR实验结果为：阳性对照组、HA颗粒组和Ta组THP-1细胞表达IL-6和TNF-a的水平均高于空白对照组,且差异有统计学意义(P<0.05)。而HA颗粒组与Ta组THP-1细胞表达IL-6和TNF-a的水平则低于阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。此外,随着时间的延长,各实验组IL-6和TNF-a的表达水平均呈现增加的趋势,但相同处理方法不同培养时间的实验组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.体外细胞毒性试验表明,Ta颗粒体外细胞毒性实验毒级为1级,属于临床可接受范围,但长期的生物安全性还需进一步动物学实验及临床验证。2.Ta对THP-1细胞凋亡无明显影响。3.Ta对THP-1细胞的IL-6、TNF-a的分泌无明显影响,一定程度上减少了部分炎症因子对种植体周围软硬组织炎症、骨组织吸收的不良影响,对改善种植体的远期疗效有一定的帮助,为Ta的临床使用提供了依据。4.将Ta引入种植体涂层的开发具有一定的可行性,但其作为涂层的强度及结合方式等有待进一步探索。