结直肠癌是严重威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤,近年来结直肠癌的发病率与死亡率逐年上升,而转移是导致结直肠癌患者死亡的重要因为。因此,探讨结直肠癌转移相关的分子机制及寻找预防和治疗的有效途径是目前结直肠癌研究的重要内容。　　 SATB2又名AT富含序列结合蛋白2,是一种特异性的核基质结合蛋白。SATB2参与染色质重构和组织特异性基因的表达调控等过程。前期课题组发现,SATB2在原发性结直肠癌或伴有远处转移的结直肠癌中的表达低于正常结肠组织。SATB2低表达水平与患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小、肿瘤分化程度及血CEA水平无关,而与肿瘤侵犯程度、淋巴结转移、远处转移及Duke分期密切相关。单变量和多变量生存分析提示高表达SATB2是预测结直肠癌预后的一个有利因子。但是SATB2在结直肠癌中的作用和机制仍有待进一步。　　 研究方法　　 1.SATB2对结直肠痛细胞生物学特性的影响:我们观察SATB2过表达对结直肠癌相关细胞系细胞生物学行为的影响。在对SATB2过表达载体进行鉴定的基础上,我们将SATB2过表达载体转染结直肠癌SW480细胞及SW620细胞,运用MTT、平板克降形成实验及Transwell小室检测SATB2上调后对结直肠癌细胞增殖及迁移能力的影响。　　 2.SATB2与结直肠癌上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)之间的关系:EMT是指上皮细胞在某些情况下在形态学上发生类似成纤维细胞或间充质细胞表型的转变。目前认为EMT在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥着重要作用。结直肠癌细胞发生EMT后,分泌与原来不同的细胞因子,形成有利于侵袭的细胞外基质,发生EMT的结直肠癌细胞在新的微环境定植。转录因子SATB2是否可以通过调控结直肠癌细胞EMT而介导肿瘤的侵袭和转移?我们采用荧光定量PCR技术观察了结直肠癌细胞SW480和HT29上调SATB2表达后,其EMT上皮标记物(E-cadherin、a-catenin、CK)、间质标记物(Vimentin、Nβ-caterin.、Fibronectin)及EMT转录因子(Snail、Slug)等表达水平的变化,以探讨SATB2与结直肠癌细胞EMT的可能关系。　　 3.SATB2参与肿瘤干细胞相关基因的表达调控:结直肠癌干细胞在启动结直肠癌的发生、发展及转移中起重要作用。SATB2是否可通过参与结直肠癌干细胞相关基因的表达调控,在结直肠痛的发生、转移中是发挥重要作用。　　 (1)应用免疫荧光共定位的方法检测新鲜临床结直肠癌组织标本中SATB2与结直肠癌干细胞标记物CD133的表达情况,观察SATB2在结直肠癌干细胞中的表达情况。　　 (2)用荧光定量的方法检测临床68对配对结直肠癌组织标本中SATB2与干细胞相关基因(Nanog、CD133、CD44、CD24、KLF2、AXIN2、Meis2、OCT4),分析它们在mRNA水平是否存在相关性。　　 (3)运用荧光定量PCR的方法检测结直肠痛细胞SW480和SW620上调SATB2后,干细胞相关基因mRNA表达水平的变化。　　 (4)运用生物信息学方法(Genomatix在线软件)预测转录因子SATB2与干细胞相关基因启动子区域的结合位点。　　 (5)应用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation assay,CHIP)证实和验证这些干细胞相关基因的启动子区域是否存在与转录因子SATB2结合位点。　　 4.SATB2参与调控的microRNA　　 (1)应用microRNA芯片检测SATB2上调后的HT29细胞microRNA的改变。　　 (2)运用生物信息学预测其中兴趣microRNA的潜在靶标蛋白,并应用Westernblot进行验证。　　 结果　　 1.SATB2对结直肠癌细胞生物学特性的影响:MTT法结果显示,与SW480-Mock细胞相比,SW480-SATB2+细胞的增殖能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=1787.153,P=0.000)；与SW620-Mock细胞相比,SW620-SATB2+细胞的增殖能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=129.146,P=0.000)。SATB2基因的导入可以抑制结直肠癌细胞的体外增殖能力。　　 细胞平板克隆形成实验结果显示SW480-SATB2+细胞的单个细胞增殖能力明显低于SW480-Mock,差异具有统计学意义(t=-9.243,P=0.001)；SW620-SATB2+细胞的单个细胞增殖能力明显低于SW620-Mock,差异具有统计学意义(t=-7.559,P=0.002)。可见结直肠癌细胞株上调SATB2后克隆形成能力明显减弱。　　 体外运动小室实验显示,SW480-SATB2+细胞的运动能力明显低于SW480-Mock,差异具有统计学意义(t=-10.814,P=0.000)；SW620-SATB2+细胞的运动能力明显低于SW620-Mock,差异具有统计学意义(t=-19.190,P=0.000)。说明SATB2上调后结直肠癌细胞株侵袭能力明显减弱。　　 2.SATB2与结直肠癌EMT之间的关系:荧光定量PCR检测分析表明,结直肠癌细胞株SW480上调SATB2后,SW480-SATB2+细胞组与对照组SW480-Mock相比,只有EMT间质标记物FN(Fibronectin)表达水平下调,差异具有统计学意义(t=-20.406,P=0.000)；结直肠癌细胞株HT29上调SATB2后,HT29-SATB2+细胞组与对照组HT29-Mock相比,EMT上皮标记物CK上调,差异具有统计学意义(t=18.593,P=0.000),EMT间质标记物Nβ—cateinin上调,差异具有统计学意义(t=5.407,P=0.006),EMT相关转录因子snail上调,差异具有统计学意义(t=7.373,P=0.002)。,结直肠癌细胞发生EMT时,主要表现为E-cadherin等上皮标记物表达缺失或降低,而间质标记物表达增加,转录因子上调进一步抑制E-cadherin的表达。从荧光定量PCR的结果看出SW480和HT29这两株结直肠癌细胞上调SATB2后EMT相关标记物存在不同的反应,SATB2在结直肠癌转移中的作用可能并不是主要通过调控结直肠癌细胞EMT这一过程。　　 3.SATB2参与肿瘤干细胞相关基因的表达调控　　 (1)临床新鲜结直肠癌组织免疫荧光的结果显示,在癌组织边缘存在少数细胞SATB2表达阳性,它可与肿瘤干细胞的标记物CD133存在明显的共定位,同时应用上皮细胞的标记物CK进行分析,这些SATB2表达阳性的细胞是上皮来源的。这些SATB2与CD133共定位的细胞可能是结直肠癌干细胞。　　 (2)对68对配对结直肠癌组织标本SATB2与干细胞相关基因在mRNA水平的Bivariate双变量相关分析显示,SATB2与CD24、AXIN2存在显著相关关系；并与结直肠癌干细胞标记物CD133及Oct4存在可能的联系(P值均为0.052)。　　 (3)荧光定量PCR的结果表明,与各自的对照组相比,结直肠癌细胞株SW480、SW620上调SATB2后,干细胞相关基因KLF2、KLF4、CD24、CD133、AXIN2、SOX2均出现明显的上调,CD44的改变趋势不一致,而Meis2表达水平较对照组几乎无改变。　　 (4)Genomatix在线软件生物信息学方法预测发现,在CD133、CD44、AXIN2、Meis2、Nanog的某些启动子区域存在SATB2的结合位点,并且某些基因启动子在一些哺乳动物种属(例如黑猩猩、洹河猴、小鼠等)同源存在保守性,提示SATB2调控此类启动子的可能性大。　　 SATB2作为一个核转录因子,对结直肠癌干细胞相关基因存在调控,形成一个调控网络,在结直肠癌的转移中发挥重要作用。　　 4.SATB2参与调控的microRNA　　 (1)CCDTM-miRNA850-V4px miRNA芯片检测结果表明,结直肠痛细胞株HT29上调SATB2后的差异microRNA22个,其中上调的microRNA2个,下调的microRNA20个。　　 (2)生物信息学方法预测发现,SATB2下调的hsa-miR-202的潜在标靶蛋白之一DICER。Western blot结果显示结直肠癌细胞株SW480和SW620上调miR202后DICER表达水平较对照组低,而下调miR202后DICER表达水平较对照组改变不明显。　　 结论:　　 1.SATB2上调与结直肠癌细胞的增殖能力、克隆形成能力和侵袭能力呈现负向相关性。　　 2.SATB2在结直肠癌转移中的作用可能并不是主要通过结直肠癌EMT这一途径。　　 3.SATB2参与调控结直肠癌干细胞相关基因,是结直肠癌干细胞的调节因子。　　 4.SATB2参与调控microRNA,SATB2上调后miR202表达下调,miR202负性调控DICER。