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背景与目的:脑胶质瘤是中枢神经系统肿瘤,也是颅内最常见的原发性肿瘤,起源于神经上皮胶质细胞,约占颅脑肿瘤的50%,且发病率高、致残率高、致死率高,严重影响患者生存,随着神经影像学及医学质量的整体发展,脑胶质瘤的诊断已不存在因难,而且脑胶质瘤已在手术、放疗和化疗等治疗方面取得了极大进步,但由于脑胶质瘤细胞增殖活跃、迁移侵袭能力强,对主要化疗药物自身耐药或获得性耐药致使患者预后不良。替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)作为新一代烷化剂化疗药,因其副作用小、疗效显著、易吸收等特点,现为临床上治疗脑胶质瘤的一线化疗药,极大部分恶性脑胶质瘤都给予手术切除肿瘤组织后辅以6个周期的TMZ化疗的标准治疗方案,但由于在临床实践中TMZ耐药的产生,使化疗效果欠佳,统计分析发现,给予标准治疗后恶性脑胶质瘤的中位无进展生存时间仅为7.9个月,全期生存时间也仅为1年左右。虽然,TMZ是已知脑胶质瘤化疗药物中疗效最为肯定的,但通过大量临床研究发现,TMZ对恶性脑胶质瘤的有效率仍不足45%,国内外已有大量科学家针对治疗脑胶质瘤的新药及化疗药物耐药机制进行研究,但经过多年努力,仍未找到有效的治疗药物及明确耐药机制。因此,找出脑胶质瘤特异性标志物,做到早期筛查、早期诊断、早期预防及服药后疗效监测,使患者能够早期治疗或治疗时结合自身情况找到最适用药浓度已成现在迫切解决的问题。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一类广泛存在动植物中的非编码小分子RNA,长度约为25个NT(核苷酸),主要参与转录后基因调控,近年来研究发现,miRNA广泛参与细胞分化、增殖、凋亡和代谢的调节,在脑胶质瘤中起到极其重要的作用,miRNA在脑胶质瘤中主要具有激活因子和抑制因子两种作用,激活因子在脑胶质瘤中高表达,抑制因子在脑胶质瘤中低表达。miR-124(microRNA-124)是颅内最常见的miRNA,作为抑制因子在脑胶质瘤细胞中呈低表达水平,且与肿瘤恶性程度相关,恶性程度越高表达水平越低,并且已被证实miR-124可通过调节多种蛋白的表达而影响细胞活性,国内外已有多项研究表明,通过细菌等转染miR-124到脑胶质瘤细胞后能有效控制胶质瘤细胞活性,综上所述,TMZ可抑制胶质瘤细胞增殖,而且过表达miR-124后可抑制肿瘤进展,我们预测TMZ可能与miR-124的表达有关,本研究将通过不同浓度的TMZ作用于人脑胶质瘤细胞系U251细胞,观察不同浓度TMZ作用下细胞抑制率,在证实TMZ对U251细胞有效的情况下,再进一步测定不同浓度时miR-124的表达量,探索miR-124能否作为临床用药过程中疗效的检测以及是否发生抗药性的生物学标志物。方法:体外传代培养人脑胶质瘤细胞系U251细胞至对数期,接种于96孔培养板,分为空白对照组和实验组,设空白对照组TMZ浓度为0μM/L,实验时用DMSO对照处理,实验组分别加入10μM/L、50μM/L、100μM/L、200μM/L、400μM/L的TMZ,通过不同浓度的TMZ(0、10、50、100、200、400μM/L)处理人脑胶质瘤细胞U251,每个药物浓度设9个复孔,培养48h后,每组中随机取出3个复孔通过噻唑兰比色法(MTT)检测490nm处的OD值,并转换为细胞的增殖抑制率。在证实TMZ对U251细胞有效的情况下,取其余6个复孔中相同数量细胞通过实时定量PCR法检测miR-124在不同浓度TMZ作用后的表达量。实验采用U6作为内标,结果采用归一化样品目的基因的相对表达率(relative expression,RE),所有结果均使用SPSSl9.0统计软件对所得实验数据进行统计学分析。结果:U251细胞经不同浓度TMZ(0、50、100、200、400μM/L)处理48h后,通过MTT法检测细胞抑制率,结果显示:TMZ浓度<50μM/L时,对细胞增殖抑制效应不明显,与对照组及组件均比较无统计学差异(P>0.05);TMZ浓度100~200μM/L时,对细胞增殖的抑制效应明显,与对照组比较均有明显统计学差异(P<0.01),且TMZ浓度在50-200μM/L范围内时细胞抑制明显,呈明显递增趋势,当浓度为400μM/L时,抑制率约64%,抑制效应较对照组有统计学意义(P<0.01),但与TMZ浓度为200μM/L时的细胞增殖抑制率相比抑制效应变化不明显(P>0.05)。在上述实验基础上,用实时定量PCR法检测miR-124表达量,结果显示:miR-124在实验组及空白对照组都表达,且miR-124与MTT实验呈正性相关,TMZ浓度<50μM/L时,与对照组比较无统计学差异(P>0.05);TMZ浓度为(100、200、400μM/L)时与对照组(TMZ为0μM/L)相比miR-124表达水平有明显统计学意义(P<0.01),且在50-200μM/L范围内表达差异较大,各组间均有统计学意义,呈明显的剂量依赖性;当TMZ为400μM/L时,表达量最为显著,但相对于TMZ为200μM/L时无统计学意义。结论:1、TMZ能抑制脑胶质瘤细胞活性,一定范围内具有药物浓度依赖性;2、MiR-124的表达水平与TMZ浓度在一定范围内正相关,可以作为TMZ在用药过程中疗效和耐药性检测的生物学标志物。