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第一部分抗TfR人鼠嵌合抗体诱导K562细胞凋亡及其机制【目的】在前期构建与表达抗转铁蛋白受体（TfR）人鼠嵌合抗体，以及研究其肿瘤组织相对特异性分布，并能介导ADCC和CDC效应的基础上，进一步探讨抗TfR人鼠嵌合抗体诱导K562细胞凋亡及其可能机制。【方法】①复苏液氮中冻存的分泌抗TfR人鼠嵌合抗体的转染瘤细胞，通过G418筛选后，用ELISA检测转染瘤细胞培养上清TfR人鼠嵌合抗体的表达；②将分泌嵌合抗体的转染瘤细胞腹腔注射诱导裸鼠（Balb／c，nu／nu）腹水抗体，并经DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析法纯化；③将抗体以不同浓度与K562细胞孵育，以活细胞计数和MTT法检测其对K562细胞生长与增殖的影响；④用琼脂糖凝胶电泳，透射电镜和Annexin V-PI染色流式细胞术（FCM）检测K562细胞凋亡；⑤PI染色FCM检测抗体对K562细胞周期的影响；⑥采用细胞色素C释放试验和ELISA法检测凋亡细胞胞浆中细胞色素C和活化的caspase-8。【结果】①1×105个转染瘤细胞在20％FCS的1640培养基中，培养5天的上清中分泌量为0.5μg／ml～5μg／ml。腹水所得纯化的抗体浓度可达1～2mg／ml左右，表明液氮中冻存两年的转染瘤细胞仍能稳定分泌抗TfR的人-鼠嵌合抗体；②抗TfR抗体可明显抑制K562细胞的增殖，在终浓度为25mg／ml到100mg／ml间具有剂量和时间的依赖性；③抗TfR抗体和K562细胞共孵育后，琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA梯形条带；用透射电镜可观察到有凋亡细胞形态学改变，细胞核不规则，核染色质凝集并着边，凋亡小体出现，其内可见染色质现象；FCM检测K562细胞凋亡率为13.08％±2.01％，表明抗TfR抗体能够诱导K562细胞发生凋亡，且具有时间-浓度依赖性；④PI染色流式细胞仪检测发现抗TfR抗体将K562细胞的细胞周期阻止在G1期；⑤细胞凋亡时胞浆中细胞色素C有增加但活化的caspase-8没有增加，表明该抗体通过线粒体死亡途径诱导K562细胞凋亡。第二部分抗TfRscFv-GAL4融合蛋白的构建、表达与鉴定【目的】本研究构建TfRscFv-GAL4的表达载体，并研究融合蛋白TfRscFv-GAL4与肿瘤细胞结合的特异性。【方法】①采用PCR技术从含有抗TfRScFv质粒pUC19中扩增TfRScFv基因片段，双酶切从含有GAL4质粒pABga14中获得GAL4的基因片段，将TfRScFv和GAL4基因片段克隆至pET28a（+）表达载体中，进行测序；②将含抗TfRScFv-GAL4-pET28a重组质粒转化大肠杆菌BL21中IPTG诱导表达；SDS-PAGE电泳及光密度扫描鉴定其表达，体外复性、透析；③采用GAL4抗体ELISA检测复性后的抗TfRScFv-GAL4融合蛋白中GAL4活性；④采用GAL4抗体FCM检测复性后的抗TfRScFv-GAL4融合蛋白与不同肿瘤细胞株的结合，免疫组化染色检测抗TfRScFv-GAL4融合蛋白与胃癌组织芯片和乳腺癌组织芯片的结合特性。【结果】①重组质粒TfRScFv-GAL4-pET，用NcoⅠ／NotⅠ双酶切，经1％琼脂糖电泳鉴定可见约1200bp的酶切产物，符合融合基因的理论值，登陆http://www.ncbi.nlm.nh.gov/blast分析所得基因序列含有TfRScFv和GAL4序列，阅读框正确；表明重组表达载体TfRScFv-GAL4-pET构建成功；②TfRScFv-GAL4-pET重组表达载体阳性转化菌经IPTG诱导4h和6h时表达量最高，蛋白条带灰度扫描显示该特异性蛋白条带约占菌体总蛋白的45％和42.3％，融合蛋白以包涵体形式表达，分子量约为47KD左右，与理论计算值一致；通过纯化、复性后，所得TfRScFv-GAL4融合蛋白的浓度为1.7mg／ml；③ELISA结果显示，复性后的TfRScFv-GAL4融合蛋白能被鼠源性GAL4抗体特异性识别；表明复性后的TfRScFv-GAL4融合蛋白中GAL4蛋白片段具有与抗体结合活性；④FCM检测结果显示，复性后的TfRScFv-GAL4融合蛋白中TfRScFv能与肿瘤细胞表面FfR结合，在所检测的7种肿瘤细胞株中，抗TfRScFv-GAL4融合蛋白与肿瘤细胞结合率在54.11％到8.23％之间，TfRScFv-GAL4组和鼠源性抗TfR抗体与各种肿瘤细胞的结合率无明显差别；组织芯片免疫组化技术检测结果显示，复性后的TfRScFv-GAL4融合蛋白和鼠源性抗TfR抗体均能与胃癌组织芯片与乳腺癌组织芯片特异性结合，染色后胃癌组织芯片阳性率分别为75.32％和78.46％，乳腺癌两张组织芯片阳性率分别为63.25％和64.57％；在正常组织中除5例肝组织中为弱阳性外，在心、脾、肾上腺皮质、血管中均为阴性。以上结果表明，复性后的TfRScFv-GAL4融合蛋白中TfRScFv蛋白片段具有与肿瘤细胞结合的特异性。第三部分TfRscFv-GAL4融合蛋白靶向目的基因表达与效应【目的】构建报告基因与效应基因的双表达载体，研究TfRscFv-GAL4融合蛋白靶向目的基因表达与效应。【方法】①体外合成GAL4 DNA Binding Domain的识别序列GAL4rec，将其插入SurvivinsiRNA-pGes载体中，酶切与测序鉴定；②4.5％非变性聚丙烯凝胶电泳分析GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes质粒与抗TfRscFv-GAL4蛋白结合，以及两者结合的摩尔比；③倒置荧光显微镜观察TfRScFv-GAL4介导的靶向复合物内吞作用及目的基因的表达；④Hochest染色检测TfRScFv-GAL4-GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes复合物诱导肿瘤细胞凋亡。【结果】①重组GAL4rec-SurvivinSiRNA-pGes载体经EcoRI酶切鉴定结果表明，插入识别序列GAL4rec后，载体质粒不能被EcoRI切成线性，在琼脂糖凝胶电泳移动较快；②载体质粒测序结果登陆http://www.ncbi.nlm.nh.gov/blast分析表明，载体质粒的测序报告中均可见插入的GAL4rec片段，表明重组表达载体GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes构建成功；③4.5％非变性的聚丙烯凝胶电泳可见抗TfRScFv蛋白加入不同浓度GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes载体，蛋白染色只有一条条带；而GAL4蛋白和抗TfRScFv-GAL4蛋白随加入的GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes载体量的增加，向上移位的蛋白增多，表明TfRscFv-GAL4融合蛋白可通过其中GAL4片断与GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes载体特异性结合；GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes和TfRScFv-GAL4蛋白结合的摩尔比为1∶2.5；④靶向复合物系统TfRScFv-GAL4-GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes和TfRScFv-GAL4-GAL4rec-pGes分别与4种人类肿瘤细胞共孵育后，在荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光蛋白表达，而其他各实验对照组均未见细胞内有绿色荧光蛋白表达。在光镜下可见靶向复合物系统组有部分贴壁细胞胞质回缩，胞体趋于变园，似凋亡细胞的形态，而其他各实验组细胞贴壁，生长良好；⑤靶向复合物系统TfRscFv-GAL4-GAL4rec-SurvivinsiRN-pGes与2种人类肿瘤细胞共孵育后，用Hochest染细胞核观察细胞凋亡现象，靶向复合物系统组可见大量的凋亡细胞，而其他组凋亡细胞较少；叠加照片显示光镜中所见胞质回缩，胞体趋于变园的细胞，均为凋亡的细胞。【结论】①研究结果表明，抗TfR人鼠嵌合抗体可以明显抑制K562人红白血病细胞增殖与诱导其凋亡，通过线粒体死亡途径是诱导K562细胞凋亡的机制之一，可能与其干扰细胞铁离子转运有关；②成功构建并表达TfRscFv-GAL4融合蛋白，通过复性后其具有较好的生物活性，抗TfRScFv和GAL4融合没有影响各自的功能；③首次证明抗TfRscFv-GAL4融合蛋白能与多种人类肿瘤细胞株以及多种肿瘤组织细胞结合，而与正常组织结合较弱或呈阴性反应，表明融合蛋白具有肿瘤组织相对特异性；④首次证明TfRscFv-GAL4-GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes复合物与肿瘤细胞孵育后能进入细胞内表达绿色荧光蛋白，并能诱导肿瘤细胞凋亡。表明TfRscFv-GAL4具有较好的肿瘤靶向性，并能介导双基因表达载体在肿瘤细胞中的表达。