【摘 要】
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叶绿体转化体系具有表达原核性,可同时进行多基因转化、超量表达、后代遗传稳定、定点整合、不会产生基因沉默及母性遗传和安全性好等特点.油菜是重要的油料作物,其质体定位
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叶绿体转化体系具有表达原核性,可同时进行多基因转化、超量表达、后代遗传稳定、定点整合、不会产生基因沉默及母性遗传和安全性好等特点.油菜是重要的油料作物,其质体定位的乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoAcarboxylase,ACCase,EC 6.4.1.2)催化乙酰辅酶A形成丙二酰辅酶A,是脂肪酸合成途径中的第一个限速步骤.对该酶基因进行叶绿体转基因的研究具有重要意义.利用PCR技术克隆了用于同源重组的油菜叶绿体DNA片段和羧基转移酶β亚基基因(β-CT或ACCD),又利用RT-PCR技术克隆了质体定位的生物素羧化酶全长cDNA(BC)与生物素羧基载体蛋白全长cDNA(BP4与BP6),运用RT-PCR、RACE和Genome walking三种技术进行组合克隆,首次克隆到质体定位的羧基转移酶α-亚基的全长cDNA.分别将组成甘蓝型油菜质体定位的乙酰辅酶A羧化酶四个亚基的基因克隆到大肠杆菌表达载体、毕赤酵母表达载体和杆状病毒表达载体上,这四个亚基的基因分别在大肠杆菌和昆虫细胞中成功表达.选用在大肠杆菌中表达的融合蛋白制备这四个亚基的抗体.利用本研究室构建的叶绿体表达盒,构建了油菜单交换、双交换叶绿体表达载体各三套,它们均带有筛选标记荧光蛋白基因(gfp),分别带有氨基糖苷3′-腺苷酰基转移酶基因(aadA)、甜菜碱醛脱氢酶基因(betB)和另一个甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)三个筛选标记.最后将以上表达盒分别在大肠杆菌中表达,表达产物通过功能验证或Western印迹验证,结果表明,组成质体定位的乙酰辅酶A羧化酶的四个亚基的基因均成功表达.
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