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丛枝菌根真菌是一类土壤有益真菌,在帮助植物吸收土壤矿质营养、提高植物抗逆性、改善土壤理化性质、土壤重金属污染的修复上具有重要的作用。该类真菌是一类与高等植物专性共生的真菌,目前还未实现其纯培养的研究,限制了AM真菌在农林生产上的规模化应用。双重培养体系是研究AM真菌离体纯培养的最佳方法,本试验通过建立烟草Ri-TDNA转型根与盾巨孢囊霉属真菌孢子的双重培养体系,探索影响AM真菌生长发育的因素并进行优化,获得了成熟AM的真菌次生孢子。本研究通过对AM真菌(盾巨孢囊霉属)孢子的表面消毒萌发及烟草Ri-TDNA转型根的诱导及优化培养;建立AM真菌孢子与烟草Ri-TDNA转型根的双重培养体系;探索并优化AM真菌与烟草转型根的双重培养体系的影响因子,观察记录AM真菌生长发育的全过程,获得大量AM真菌次生孢子;通过萌发试验检测次生孢子的活力,证实了离体双重培养体系的可行性。试验结果如下:1、2%(w/v)氯胺T与0.25%(v/v)Tween20混合液浸泡10min,无菌水冲洗3次以上,再用(抗生素)0.02%(w/v)硫酸链霉素和0.01%(w/v)硫酸庆大霉素混合液浸泡10min,无菌水清洗3次以上接种于0.8%的水琼脂培养基(pH6.0)上25oC恒温培养箱内萌发,萌发效果较好,萌发率可达到80%左右,污染率在5%以下。2、用发根农杆菌A4侵染烟草无菌苗叶片诱导烟草转型根,且菌液浓度OD600值在0.6-0.8间处诱导效果最好;然后在含有头孢霉素的MS培养基上对所获得的烟草转型根进行除菌;并在建立双重培养体系前于MSR培养基上进行适应性培养。3、孢子的接种量、接种方式及接种时间均对双重培养体系有一定的影响。孢子的接种量影响菌丝的总量,选取预先萌发且萌发管较多、菌丝粗壮的孢子建立双重培养体系,大大提高了菌丝与毛状根相互识别的机率,同时接种时将萌发管的方向正对毛状根有助于加快两者的相互识别。4、温度、光照、外源信号物质都不同程度的影响了AM真菌菌丝的生长,进而影响AM真菌菌丝的分化发育形成次生孢子。因毛状根及孢子自身的属性,暗培养效果较好;早期选择25oC恒温培养够保证毛状根的生长,给AM真菌菌丝营养生长阶段提供良好的营养物质,后期菌丝转为营养生长后4oC与30oC交替培养更能刺激菌丝进一步分化形成次生孢子;外源信号物质精胺、银杏叶提取物(黄酮类)、GR24均影响了菌丝的生长,尤其体现在菌丝的分枝数和侵染率上。银杏叶提取物浓度在160mg/L时菌丝分枝量最大,精胺浓度在150mg/L时菌丝总量达到最大,GR24浓度在450pg/L时,毛状根和菌丝的分枝数达到最大,侵染率也最高。5、AM真菌与烟草转型根建立离体双重培养体系获得的次生孢子能够在水琼脂培养基上二次萌发,常温和低温处理AM真菌孢子。孢子的萌发率均有所下降,4oC低温处理能够打破孢子的休眠,萌发率可达到63%左右,次生孢子萌发污染率高达20%左右本试验通过建立盾巨孢囊霉属真菌孢子与烟草Ri-TDNA转型根的离体双重培养体系,完善了离体双重培养体系并对其影响因子进行优化试验。试验获得了大量幼嫩的AM真菌次生孢子及部分成熟的AM真菌次生孢子,并对次生孢子进行了活力鉴定,观察并记录了AM真菌的生长发育全过程。