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小麦温光敏雄性不育材料为我国特有资源,拥有完全独立的自主知识产权,近十年来发展极为迅速,已经成为国内外小麦杂种优势利用的主要育种途径。本实验以温光敏雄性不育系BS20为材料,进行均一化cDNA文库构建、大规模cDNA测序、EST序列生物信息学分析,以及小麦雄蕊发育过程中微管、微丝细胞骨架激光共聚焦荧光标记体系探索等方面的研究,旨在为更好的揭示温光敏雄性不育分子机理搭建平台。本实验所获得的主要研究结果如下:1.温光敏雄性不育小麦穗部发育时期均一化cDNA文库构建、鉴定和EST分析(1)按照雄蕊不同发育时期,即小花分化期,药隔形成期,小孢子母细胞时期,四分体时期,单核花粉期和成熟花粉期,构建了6个独立的温光敏雄性不育小麦穗部和花药组织cDNA文库。除了小孢子母细胞时期构建的文库之外,其余5个文库的重组率均为100%。每个独立文库的库容量在1.6×10~6-2.0×10~7之间,平均插入片段长度大于0.85 kb。(2)通过与基因组饱和杂交的方法混合6个独立cDNA文库构建穗部发育时期均一化cDNA文库。文库库容量为4.0×10~5,平均插入片段长度为1.3 kb。(3)从均一化cDNA文库中随机挑选3264个克隆进行5′单向测序,剔除长度小于100 bp序列之后,共获得了3223条去载体序列的EST序列,其平均测序长度为926bp。通过聚类和拼接,结果产生2175条非冗余EST聚类,其中包括423条contig和1752条singleton,我们将它们合称为温光敏雄性不育小麦穗部发育相关UniGene(TPGMSSUniGene)。(4)通过综合利用不同序列比对工具的优势,检索多个数据库对TPGMSSUni-Gene进行功能注释。结果显示有60%的UniGene有功能注释。其中有264条(占总数的12%)在CSRD数据库中存在高度同源序列。它们主要是编码初生代谢相关基因、信号转导相关基因和转录调节相关基因。(5)2715个UniGene进行简单重复序列扫描。结果有108个二至六核苷酸为重复基序的SSR位点被找到,其中三核苷酸重复基序的SSR数量最多。2.小麦减数分裂时期细胞骨架荧光标记体系的探索(1)多聚赖氨酸直接粘片法:虽然通过改进固定液配方、针对微管微丝采用不同的固定时间和酶解时间,但还是发现这种方法存在细胞脱落情况严重,组织细胞粘片效果不佳和组织碎片荧光背景干扰等问题,不适合进行小麦雄蕊发育过程中微管、微丝细胞骨架荧光标记。(2)低熔点石蜡切片法:微管、微丝荧光标记效果较好,无背景杂质荧光信号干扰,克服了细胞脱落的情况,可以观察不同发育时期的小孢子细胞骨架结构。通过优化改进实际操作步骤等方面,最终总结出适合小麦雄蕊发育过程中微管、微丝细胞骨架观察的低熔点石蜡切片荧光标记体系。