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目的:本实验的研究目的是验证切牙错颌模型对小鼠颞下颌骨关节炎建模的有效性,并且探索 MicroRNA-21-5p(miR-21-5p)及其靶基因 Sprouty1(Spry1)在小鼠颞下颌骨关节炎(temporomandibular joint osteoarthritis,TMJOA)疾病进展中所发挥的调节作用。方法:体内动物实验选用miR-21-5p-/-C57BL/6基因敲除小鼠(miR-21-5p-KO)及野生型C57BL/6(WT)小鼠,通过单侧前牙错颌模型(unilateral anterior crossbite,UAC)构建小鼠TMJOA,探究敲除miR-21-5p对小鼠TMJOA的作用。体外细胞学实验选用C57BL/6小鼠原代髁突软骨细胞(mandibular condylar cartilage cells,MCCs),探索miR-21-5p及其靶基因Spry1调节MCCs细胞外基质降解及血管化的具体机制。第一部分:将20只WT小鼠随机分为对照组(WT-NC)和单侧前牙反颌组(WT-UAC)。将20只miR-21-5p-KO小鼠随机分为对照组(KO-NC)和单侧前牙反颌组(KO-UAC)。干预时间为3周。通过甲苯胺蓝及aggrecan(ACAN)免疫组织化学染色观察小鼠TMJ软骨的病理变化;应用Western blotting测定各组小鼠髁突软骨中Spry1、VEGF、MMP-13的表达水平的变化;第二部分:采用双荧光素酶报告分析,验证Spry1为miR-21-5p的靶基因。RT-qPCR检测 miR-21-5pRNA表达量,Western blotting测定 Spry1 蛋白表达量。第三部分:体外培养MCCs,RT-qPCR检测经miR-21-5p mimic和inhibitor转染后的软骨细胞中miR-21-5p的表达后,以及RT-qPCR、Western blotting检测Spry1、VEGF、MMP-13、p-ERK1/2 的表达变化情况;第四部分:体外培养MCCs,RT-qPCR,Western blotting检测经IL-1β处理和 miR-21-5p 的表达情况,Western blotting 检测经 miR-21-5p mimic 和 inhibitor转染后的软骨细胞中Spry1,VEGF,MMP-13,p-ERK1/2的表达变化情况;通过免疫荧光,测定髁突软骨中Spry1和ACAN的表达变化;通过甲苯胺蓝染色观察MCCs酸性黏多糖水平的改变;第五部分:Western blotting检测髁突软骨细胞在IL-1β的刺激下,将miR-21-5p inhibitor 与 si-Spry1 或 cDNA Spry1 共转染后,VEGF,MMP-13 及p-ERK1/2表达水平的变化;第六部分:鸡胚成血管实验分析miR-21-5p对TMJ软骨血管生成的作用,以及该作用是否被ERK-MAPK信号通路所介导。结果:(1)甲苯胺蓝染色面密度值,软骨厚度值,免疫组织化学染色,RT-qPCR及Western blotting结果显示敲除miR-21-5p对骨关节炎小鼠具有软骨保护作用,并抑制UAC诱导的OA中软骨基质的丢失。(2)miRNA靶数据库预测得出Spry1是miR-21-5p的靶基因。荧光素酶实验显示,Spry1是miR-21-5p在软骨细胞中的下游靶点。用miR-21-5pmimic转染MCCs后Spry1蛋白表达显著下调,而miR-21-5p抑制剂转染后Spry1蛋白表达显著上调。(3)RT-qPCR结果显示miR-21-5p mimic转染MCCs后miR-21-5p的表达较mimic NC组明显增加,而miR-21-5p inhibitor组miR-21-5p的表达明显抑制。miR-21-5p mimic组的Spry1、VEGF和MMP-13的mRNA和蛋白表达水平较mimic NC组显著升高,而ACAN的表达水平下调。与对照组相比,miR-21-5p inhibitor组Spry1、VEGF和MMP-13的mRNA和蛋白表达降低,ACAN表达上调。(4)应用IL-1β诱导MCCs炎性状态。经过IL-1β处理后的MCCs中miR-21-5p表达水平有明显的升高,Spry1的蛋白表达下调,VEGF,MMP-13和p-ERK1/2的蛋白表达出现明显上调。在IL-1β诱导下,mimic miR-21-5p组的VEGF,MMP-13和p-ERK1/2蛋白的表达明显的上调,inhibitormiR-21-5p组结果相反。甲苯胺蓝染色结果也提示了 miR-21-5p在IL-1β介导的细胞外基质分解代谢通路中起到了促进作用。(5)免疫荧光结果显示,IL-1β+mimic miR-21-5p组的Spry1和ACAN的荧光强度明显低于miR-21-5p mimic组和IL-1β+NC组。Spry1小干扰RNA转染显示,与IL-1β+si-Spry1 NC组相比,IL-1β+si-Spry1组VEGF、MMP-13和p-ERK1/2的表达明显上调;异位表达质粒转染显示,与IL-1 β+cDNA-NC组相比,IL-1β+cDNA-Spry1组VEGF、MMP-13和p-ERK1/2的表达显著下调。Spry1的过度表达增强了miR-21-5p抑制剂对炎症状态下VEGF、MMP-13和p-ERK1/2蛋白表达水平的抑制作用。干扰Spry1的表达减弱了此抑制作用。(6)鸡胚成血管实验显示,miR-21-5p mimic组的血管分支数目明显增多,而miR-21-5p inhibitor组的血管分支数目最少。miR-21-5p mimic与U0126联合干预组的新血管数量明显低于miR-21-5p mimic组。Western blotting显示,miR-21-5p mimic与U0126联合干预组的VEGF的表达明显低于模拟组。结论:动物实验结果证明,UAC模型是一种可靠的小鼠TMJOA模型构建法,实验组皆出现了关节软骨的退行性变。同时证明了敲除miR-21-5p对小鼠TMJOA有一定的抑制作用。细胞学实验在验证Spry1为miR-21-5p靶基因的前提下,证实了在IL-1β介导的小鼠TMJOA中miR-21-5p可通过抑制了Spry1的表达进而促进髁突软骨细胞外基质退化及血管新生。