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胰腺癌已经成为恶性肿瘤死亡原因的第四位,肿瘤经淋巴系统、血管等转移导致肿瘤扩散,最终发展为严重恶液质而死亡。标准的化疗起到的作用非常有限,对病人生存率影响不大,一个重要的原因就是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药。胰腺癌的血管生长对肿瘤的发展、转移、预后等方面起着重要的作用,因此抑制肿瘤血管生长、阻止肿瘤生长、提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,制定正确的治疗方案显得更为重要。在胰腺癌进展过程中发生一些信号分子反常调节,有些成为潜在治疗靶点,其中c-Src基因越来越引起重视。c-Src基因编码分子量为60KD的非受体蛋白酪氨酸激酶,c-Src通过调节多种信号与结构分子从而产生不同的生物学功能。c-Src在多种实体瘤中呈高表达并且提示预后较差。RNA干扰(RNAi)是一种转录后的基因沉默,它能触发某种转录后监控程序,导致特定mRNA单链的降解。其主要的作用机制为dsRNA经核酸酶降解成为21~23nt的小片断,并以其为模板,特定位点,特定间隔降解与之序列相应的mRNA。目前已成功用于基因功能和信号传递系统上下游分子相互关系的研究,为肿瘤治疗提供新策略。并为功能基因组学,基因治疗学等众多领域带来新的突破。目的:构建靶向c-Src特异性干扰RNA质粒,转染PANC-1细胞后,培养稳定的转染质粒的细胞株,检测干扰效应及肿瘤细胞特性的改变。研究RNA干扰治疗胰腺癌的可能性。方法:设计并合成靶向c-Src的siRNA,使用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000转染胰腺癌PANC-1细胞,流式细胞仪检测转染效率,实时荧光定量PCR检测c-Src及β-Actin mRNA的表达,筛选出最有效的siRNA。Western blot检测c-Src蛋白的表达。根据筛选结果构建两条DNA模板链,限制性核酸内切酶线性化空质粒后,连接酶将插入片断插入空质粒中,通过酶切鉴定及测序确定合成的质粒符合要求。使用c-Src特异性干扰RNA质粒及阴性对照质粒,分别转染PANC-1细胞,阳性细胞使用G418筛选,并挑选阳性细胞单克隆,流式细胞仪及荧光显微镜检测转染效率,MTT及流式细胞仪检测不同组细胞对吉西他滨的敏感性,ELISA检测细胞培养上清VEGF的表达,建立裸鼠皮下种植瘤模型,检测肿瘤组织c-Src及MVD的表达。结果:①脂质体LipofectamineTM 2000转染PANC-1细胞的转染效率为96.3%,最有效的siRNA抑制率为86.1%。②酶切鉴定及测序证实干扰质粒成功建立。③c-Src特异性干扰RNA质粒pSrcs及阴性对照质粒pNRNA,转染PANC-1细胞,G418筛选,在pSrcs质粒转染细胞中磷酸化Akt表达下降。④MTT及流式细胞仪结果提示:在pSrcs质粒转染细胞会增高吉西他滨导致的细胞凋亡。⑤细胞培养上清VEGF的表达在pSrcs质粒转染的细胞中呈现明显的下降。⑥在注入相应胰腺癌PANC-1细胞的裸鼠皮下模型中,c-Src及MVD在pSrcs质粒转染的细胞中明显下降。结论:使用pGPU6/GFP/Neo质粒,成功构建了c-Src特异性干扰质粒,在体内及体外实验中,pSrcs质粒转染的PANC-1细胞下调磷酸化Akt的表达,增强吉西他滨的敏感性,c-Src基因沉默会抑制肿瘤的血管形成。研究表明,c-Src基因可以成为胰腺癌基因治疗的重要候选靶点。