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研究背最平滑肌在人体内分布广泛,如呼吸道、消化道、血管、泌尿及生殖等系统。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)主要存在于血管中膜,其功能主要是维持血管正常生理功能,对机体的代谢和内分泌亦有重要作用。许多血管疾病的发病机制都涉及血管平滑肌细胞的功能障碍。在病理过程中,血管平滑肌细胞通过自身增殖、迁移及合成细胞外基质在血管疾病的损伤修复过程中扮演重要角色,例如高血压、移植血管病、血管成形术后再狭窄、脑动脉瘤、动脉粥样硬化和血管壁损伤后的修复等。核糖体作为一种非常重要的细胞器,由核糖体蛋白(ribosomal protein,RP)和核糖体RNA(rRNA)组成。核糖体蛋白有两个重要功能:一是参与细胞内蛋白质合成,二是调控细胞的生长、增殖、分化、凋亡等功能。后者被称为核糖体外功能(extraribosomal function)。因此VSMC中核糖体蛋白发生改变可能涉及不同血管疾病的发生发展。MYCT1是最早在喉癌细胞中发现的c-Myc靶基因,先前被命名为MTLC。MYCT1基因含有两个外显子并产生编码具有235个氨基酸残基的蛋白质的1006bp转录物。研究证实:MYCT1在正常组织中广泛表达,且低表达于喉癌、肝癌及胃癌等多种恶性肿瘤组织。过表达MYCT1后癌细胞增殖能力降低、凋亡增加、侵袭能力降低。未转移癌组织中MYCT1表达量大于转移癌。以往对MYCT1的研究大多数都是在各种肿瘤细胞中探索该基因对各种细胞功能的调节作用。然而目前MYCT1对VSMC的相关功能还没有研究。鉴于VSMC及RP的重要性,本课题旨在探索MYCT1是否通过影响RP的表达进而影响VSMC的功能。课题研究内容包括:(1)NOC18(模拟一氧化氮引起的硝基化应激)是否能通过调控MYCT1的表达进而影响RP的表达;(2)以pro-Collagen1α1为例,研究抑制MYCT1表达(进而影响核糖体生物合成)是否对VSMC蛋白翻译能力产生影响;(3)研究MYCT1是否对VSMC增殖、凋亡、迁移功能产生影响。研究内容及方法1.应激刺激(NOC18模拟硝基化应激)是否能通过调控MYCT1进而影响RP表达:体外培养大鼠VSMC,给予细胞NOC18刺激,采用实时定量PCR方法检测MYCT1在mRNA水平的表达变化;通过慢病毒转染过表达MYCT1或加入NOC18刺激后检测RPmRNA的表达变化;慢病毒转染shRNA敲低MYCT1表达后采用实时定量PCR和蛋白质印记方法检测RP在mRNA和蛋白质水平表达量变化。2.以胶原蛋白pro-Collagen1α1为例,研究抑制MYCT1表达是否对VSMC细胞外基质蛋白翻译能力产生影响:慢病毒转染敲低MYCT1,在基础水平和TGF-β1刺激后比较pro-Collagen1α1在mRNA水平和蛋白质水平(ELISA方法检测)的表达量是否存在差异变化,以间接阐明MYCT1表达下降是否降低VSMC蛋白翻译的能力3.MYCT1表达量变化对VSMC增殖、凋亡及迁移的作用:慢病毒转染敲低MYCT1后,采用Cell Counting Kit-8试剂盒检测VSMC的增殖能力;采用Caspase-Glo(?)3/7检测试剂盒检测VSMC凋亡能力;采用细胞划痕实验(Wound Healing)检测VSMC迁移能力。研究结果1.在大鼠VSMC中,NOC18能下调MYCT1和RP的mRNA水平;敲低MYCT1后RP mRNA和蛋白质水平明显降低。过表达MYCT1后NOC18抑制RP表达的作用被部分逆转。2.在大鼠VSMC中,TGF-β1上调pro-Collagen1α1的mRNA水平,同时相应增加pro-Collagen1α1的蛋白水平。在MYCT1敲低的细胞中,TGF-β1同样上调pro-Collagen1α1的mRNA和蛋白水平。与空载体对照相比,MYCT1 shRNA-420中pro-Collagen1α1 mRNA水平上调,但其蛋白水平下调。3.在大鼠VSMC中,敲低MYCT1后与对照组相比,细胞增殖和迁移能力减弱、凋亡增加;而正常VSMC中过表达MYCT1对细胞增殖及凋亡无显著影响。结论1.VSMC中应激刺激能通过调控MYCT1表达影响RP的表达。2.VSMC中MYCT1可能通过调控RP表达影响细胞合成(蛋白翻译)基质蛋白的能力。3.MYCT1表达改变对VSMC的增殖、迁移及凋亡产生影响;MYCT1的这些作用是否依赖于其对RP表达的调控有带后续进一步研究。4.我们的研究结果提示MYCT1调控血管平滑肌细胞RP的表达,进而影响细胞细胞合成基质蛋白的能力。MYCT1可能成为调控血管平滑肌细胞损伤修复功能的新靶点。