铁皮石斛快繁体系和细胞培养研究

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铁皮石斛为兰科多年生附生草本植物,属国家2级保护的贵重濒危药材。现代药理研究证实,铁皮石斛具有增强机体免疫力、抗肿瘤等作用。目前,铁皮石斛的市场供需严重不平衡,虽已有离体再生的报道,但其存在育苗周期长、增殖系数低等问题,扩大铁皮石斛药源,以保护铁皮石斛资源、弥补市场供需缺口具有重要意义。本研究以取自云南的野生铁皮石斛为试验材料,对铁皮石斛高效快繁体系及细胞培养进行了研究,主要研究结果如下:(1)建立了一种铁皮石斛腋芽快繁体系。结果表明:外植体的种类、NAA与6-BA的剂量及配比对丛生芽诱导率具有显著影响。以含第一茎节的茎段丛生芽的诱导率最高,达66.7%,2~3茎节略次之,诱导率为53.3%,均为较好的外植体材料。对于激素的筛选发现,NAA与6-BA的浓度比与丛芽的诱导率及增殖系数呈正相关,其中优化的丛生芽诱导培养基为1/2MS+0.5mg/L NAA+4mg/L6-BA,丛生芽诱导率高达73.3%,增殖系数达19.87。(2)建立了一种基于拟原球茎的铁皮石斛快繁体系(直接体胚再生)。以丛生芽为外植体,对拟原球茎的诱导、分化、丛生芽生根壮苗的影响因素进行研究,其最适宜培养基分别为:拟原球茎诱导:MS+1mg/LTDZ+0.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D拟原球茎分化:MS+1mg/LNAA+10mg/L6-BA生根壮苗:1/2MS++1mg/L6-BA+2mg/LNAA+6mg/L IBA+200g/L土豆汁按此体系进行培养,增殖系数最高达52.3。炼苗移栽:选取5cm以上的石斛苗,移栽至底层水苔1~2cm+蛭石松树皮混合物(体积比为1:2至1:4)+顶层水苔3~5cm,移栽成活率高达98.3%。(3)建立了铁皮石斛愈伤组织诱导及细胞驯化的技术体系。以拟原球茎为外植体,最佳诱导培养基为:MS+0.5mg/L2,4-D+0.25mg/L或0.5mg/L KT,仅需7-10d可得长势良好的愈伤组织。利用愈伤团块富集法进行定向筛选与驯化,初始1-2个月继代周期为15d,后续20d为周期,至细胞明显颗粒化,再转入MS+5mg/L NAA+0.5mg/L6-BA或KT,继代周期30d,可在6-9个月获得供悬浮培养铁皮石斛细胞系,为扩大铁皮石斛药源奠定基础。(4)对比几种不同来源的铁皮石斛组织培养物的多糖含量,进行药用潜力的品质分析,结果表明:铁皮石斛愈伤组织干湿比为7.7%,水溶性多糖及总多糖含量分别为18.18%及24.67%;拟原球茎的干湿比为4.4%,两种多糖含量分别为12.0%及17.0%;丛生芽的干湿比为6.1%,两种多糖含量分别为10.4%及15.7%;幼苗干湿比为6.7%,两种多糖含量分别为7.8%及13.8%。综合干湿比来看,四种组织培养物中愈伤组织的多糖产率最高,其他三种组织培养物多糖产率相当。云南地区的野生铁皮石斛总多糖含量一般在25%~30%,相比而言愈伤组织的多糖产率仍然具有竞争性。铁皮石斛广为接受的评价标准为多糖含量,其含量与生理活性的强弱正相关。由此可见,利用铁皮石斛愈伤组织作为铁皮石斛替代性药源是最具潜力的途径。
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