动物药僵蚕是蚕蛾科昆虫家蚕4~5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌而致死的干燥体,作为传统的中药材,使用历史悠久。僵蚕具有抗惊厥、抗癫痫、抗凝等药理作用,临床主要用于治疗惊厥、癫痫、抽搐等。僵蚕饮片有生品和炮制品之分,由于生品具有较强毒性,临床一般使用炮制品,即麸炒品。僵蚕经炮制后,毒性大大减弱,近年来对其毒性的分析往往针对其中的小分子物质,且至今没有定论,而主要的成分蛋白质尚未被深入研究。本论文主要分析僵蚕炮制前后蛋白质的变化,明确僵蚕炮制前后的差异性蛋白质,为研究僵蚕的炮制减毒机理提供依据。研究内容分为以下几个部分:1.首先将僵蚕生品炮制成麸炒僵蚕,并对僵蚕中蛋白质的提取方法进行了优化,最终确立以水为溶剂,料液比为1:50,超声提取50 mins为最佳方法。用此方法分别提取僵蚕生品、自制炮制品和市售炮制品的蛋白质,并测定了蛋白质含量。结果发现:僵蚕生品的蛋白含量明显高于炮制品,而自制僵蚕炮制品蛋白质含量略高于市售炮制品。2.对僵蚕生品以及炮制品中的蛋白质进行水解,使用氨基酸分析仪对产生的氨基酸进行了含量测定,发现两者的氨基酸组成一致,氨基酸的含量分布趋势一致,且除甲硫氨酸外,僵蚕生品中其余氨基酸的含量均高于炮制品。3.使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析僵蚕中的蛋白质,考察了不同的分离胶浓度、电泳电压对蛋白质分离效果的影响,并对僵蚕生品和炮制品中的蛋白质进行了比较。结果发现:僵蚕生品的蛋白质条带明显多于炮制品(未观察到明显蛋白质条带)。此外,将僵蚕的自制炮制品和市售炮制品进行电泳分析,发现两者差异不大。4.运用二维凝胶电泳(2-DE)进一步分析了僵蚕生品与炮制品中蛋白质的差异。考察了不同的分离胶浓度、染色方法以及蛋白质纯化方法对蛋白质分离效果的影响,并比较了僵蚕生品和炮制品的二维电泳图谱。结果表明:僵蚕生品电泳图谱上的蛋白斑点明显多于其炮制品(几乎没有斑点);但是,用饱和硫酸铵沉淀法纯化样品后,僵蚕炮制品的蛋白斑点少于其生品,主要靠近中性端。5.分别以SDS-PAGE分离得到的蛋白质条带和2-DE分离得到的蛋白质斑点为来源,用胰蛋白酶胶内消化,将消化得到的多肽混合物进一步用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,得到对应多肽片段的指纹图谱,并导入到Mascot数据库进行匹配检索。结果发现:以SDS-PAGE条带为来源,仅鉴定得到一个可信度较高的蛋白质;而以2-DE斑点为来源,经过分析后未能鉴定出可信度较高的蛋白质。6.将以上样品进一步用纳升液相色谱-电喷雾静电场轨道阱组合式高分辨质谱联用系统(Nano-LC-ESI LTQ-Orbitrap MS/MS)分析,并使用PEAKS软件对相关数据库进行搜索匹配。结果发现:以SDS-PAGE条带为来源,鉴定得到30个可信度较高的蛋白质;以2-DE斑点为来源,鉴定得到了40个可信度较高的蛋白质。