广东NDV序列分析及鸡源基因Ⅶ型感染性克隆的构建

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为了解广东地区新城疫病毒(Newcastle Disease viruses.NDV)的流行情况,本研究选择了从该地区的鹅、鸭、鸽、野鸟等不同宿主中分离到的共23株NDV进行序列分析,提取上述NDV分离株的RNA,参考GenBank中已发表的NDV F基因序列,设计出用于扩增F基因的引物,应用RT-PCR技术成功地扩增了以上分离株的部分F基因,进行测序,截取F基因47--375 nt段序列,利用Mega4.0软件进行基因分型并绘制系统进化树。   F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸的序列分析结果显示18株NDV分离株属于强毒株,5株NDV分离株属于弱毒株。其中,所有基因Ⅶ型、基因Ⅵ型分离株属于强毒株,所有基因I型分离株属于弱毒株;所有鹅源分离株属于强毒株,4株鸽源分离株中3株属于强毒株,8株野鸟源分离株中5株属于强毒株,5株鸽源分离株中4株属于强毒株。基因分型结果显示23株NDV中,6株鹅源分离株全部属于基因Ⅶ型;5株鸽源分离株中4株属于基因Ⅵ型,1株属于基因I型;8株野鸟源分离株中,3株基因I型,3株属于基因Ⅵ型,2株属于基因Ⅶ型;4株鸭源分离株中3株属于基因Ⅶ型,1株属于基因I型。结果说明基因Ⅶ型是鹅源分离株的优势基因型;基因Ⅵ型是鸽源分离株的优势基因型;野鸟源分离株存在基因I型、基因Ⅵ型、基因Ⅶ型,情况比较复杂;基因Ⅶ型是鸭源分离株的优势基因型。23株NDV中11株属于基因Ⅶ型,7株属于基因Ⅵ型,5株属于基因I型,说明基因ⅦNDV强毒株是广东地区的主要流行株,为了解广东地区的新城疫的流行情况提供了实验数据。   系统进化树分析结果显示在23株NDV野毒株中,Goose/China/60、Goose/China/61、Wildbird/China/73, Duck/China/98、Goose/China/100、Wildbird/China/74与Goose/China/102相似性高达99%,处于同一进化分支;而Wildbird/China/72、Pigeon/China/11、Widlbird/China/80、Pigeon/China/55与Widlbird/China/77相似性较高,处于同一进化分支;Wildbird/China/71、Wildbird/China/75、Wildbird/China/76、Duck/China/52与Pigeon/China/54等毒株处于同一进化分支。野鸟源分离株存在于不同进化分支,并且分别与鸭源、鸽源和鹅源分离株都具有较高的相似性。结果表明飞禽、水禽中新城疫的流行可能跟野鸟活动有关,为广东地区的新城疫的防控提供了理论支持。   在分析了广东地区新城疫流行的基本情况后,结合我国新城疫流行的主要特点及反向遗传技术的研究进展,本研究着手构建广东鸡源基因Ⅶ型NDV GM株的感染性克隆。为此,自行设计和构建了含T7启动子、终止子等元件及6型肝炎核酶序列(Rbz)的骨架质粒pCSX。在此基础上针对GM株基因组序列及限制性内切酶图谱,设计引物,通过PCR方法分段扩增出GM株的全长基因组,然后将各基因片段逐个按顺序装入骨架质粒中,最终获得了含GM株全长基因组的eDNA克隆pCSX-GM。将全长基因组cDNA克隆pCSX-GM与辅助蛋白表达质粒共转染预感染了可表达T7RNA聚合酶痘病毒的BHK-21细胞后,检测出文该病毒为新城疫毒,其序列测定结果与亲本毒株一致,命名为rGM株,所救获病毒的EIDso为10-6-5/0.2mL,ICPI为1.787,MDT为72 h,各项指标均与亲本毒株相近,为NDV基因功能的研究及新型疫苗的开发研制奠定了基础。
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