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背景:肿瘤干细胞(tumor stem cells, TSCs)是肿瘤组织中存在的极少部分具有干细胞特性的肿瘤细胞,在肿瘤生长、耐药、转移及复发中发挥重要作用[1-2]。由于肿瘤干细胞在肿瘤组织中所占比例极少,如何有效地分选富集出这小部分细胞,是研究肿瘤干细胞的首要步骤,也是难点。在本课题组前期研究中,利用肿瘤干细胞的耐药特性,建立了裸鼠体内低剂量阿霉素(adriamycin, ADM)干预的人舌癌细胞TCA-8113第四代细胞系即:Tca-8113/ADM-P4细胞。通过对此细胞系的检测发现:此富集模式还有待进一步完善。因此,为进一步寻找更好的舌癌干细胞分选富集模式。本研究采用单细胞培养形成的全克隆来分选富集舌癌Tca-8113与Tca-8113/ADM-P4细胞的干细胞。近年来研究发现:多种肿瘤细胞在体外单细胞培养时会形成三种不同类型的克隆即:全克隆(Holoclone)、部分克隆(Meroclone)和旁克隆(Paraclone)[3]。其中,全克隆最大,可达10-30mm2,呈规则的圆形或类圆形,边缘光滑,折光性好,克隆内细胞体积小、均匀、连接紧密,增殖能力极强,具有极强的成瘤能力;旁克隆最小,细胞增殖能力最差,而部分克隆的体积介于两者之间。研究表明:全克隆可能是肿瘤干细胞形成的一种克隆形态[4]。目的:通过单细胞培养观察人舌癌细胞系Tca-8113及Tca-8113/ADM-P4细胞能否形成三种不同形态的克隆。并对其形成的三种克隆进行干性检测。方法:第一部分,以Tca-8113及Tca-8113/ADM-P4为研究对象,采用有限稀释法进行单细胞克隆培养,观察三种不同形态克隆的干性生物学特性:克隆形成率、构成比、生长曲线。第二部分,采用克隆连续传代培养、无血清悬浮培养法、无血清悬浮球囊传代培养、Hoechst33342外排情况、实时荧光定量PCR和免疫缺陷裸鼠成瘤实验对第一部分形成的三种克隆进行干性检测。结果:第一部分实验,经单细胞培养Tca-8113亲本细胞与Tca-8113/ADM-P4细胞均能形成三种不同形态的克隆,其克隆形成率分别为(68.36±1.78)%、(30.72±8.03)%。将Tca-8113亲本细胞单细胞培养后形成的全克隆、部分克隆和旁克隆分别表示为Tca-8113-HC、Tca-8113-MC和Tca-8113-PC,它们的构成比率分别是(45.60±8.87)%、(30.83±9.15)%、(24.57±0.61)%;Tca-8113/ADM-P4进行单细胞培养形成的全克隆、部分克隆和旁克隆分别表示为Tca-8113/ADM-P4-HC、Tca-8113/ADM-P4-MC和Tca-8113/ADM-P4-PC,他们所占的构成比率分别为(31.87±1.03)%、(42.66±1.79)%、(25.47±6.97)%。第二部分实验,将Tca-8113亲本细胞与Tca-8113/ADM-P4细胞单细胞培养后形成的全克隆与部分克隆(旁克隆无法进行传代培养)进行单细胞克隆传代培养,进一步观察其传代后的克隆形成率与构成比率,传代后的Tca-8113-HC与Tca-8113/ADM-P4-HC细胞的克隆形成率分别为(89.12±15.17)%、(48.14±1.75)%, TCA-8113-HC连续单细胞传代后形成的全克隆、部分克隆、旁克隆构成比率分别为(73.22±8.02)%、(21.96±87.56)%、(14.82±1.61)%。Tca-8113-MC连续单细胞连续传代后形成的全克隆、部分克隆、旁克隆构成比率分别为(5.54±5.47)%、(62.81±2.05)%、(31.65±2.07)%。Tca-8113/ADM-P4-HC连续单细胞传代培养后形成的全克隆、部分克隆、旁克隆构成比率分别为(18.07±2.76)%、(48.21±3.02)%、(33.72±2.07)%。Tca-8113/ADM-P4-MC传代形成的单细胞克隆只有部分克隆和旁克隆两种类型的克隆,它们的构成比率分别是(79.32±4.80)%、(20.68±3.64)%。在本课题组前期研究中Tca-8113亲本细胞无血清悬浮培养的球囊形成率为(8.25±3.41)%,本次实验中只有Tca-8113-HC细胞在无血清悬浮培养基中形成球囊,并且其球囊形成率为(10.83±4.15)%,对Tca-8113-HC悬浮球无血清悬浮传代培养后的球囊形成率为(14.70±2.65)%。Hoechst33342染色发现:Tca-8113的部分克隆、旁克隆细胞与Tca-8113/ADM-P4的全克隆、部分克隆和旁克隆细胞均发出蓝色荧光,而Tca-8113的全克隆却出现低染或未染现象。Real-time PCR检测结果显示:CD44、CXCR4和ESA三者与舌癌干性最相关的标志物的表达水平中全克隆最高。免疫缺陷裸鼠成瘤实验显示:5w时,注射Tca-8113-HC细胞5×104组的裸鼠出现约1.2×1.5mm大小瘤体,8w最大的瘤体约9×11.5mm大小,而其他组均未见瘤体。结论:1、体外单细胞培养发现两种细胞系均能形成三种不同形态的克隆,且TCA-8113亲本细胞较TCA-8113/ADM-P4具有更强的全克隆形成能力。2、三种克隆的肿瘤干性相关特征检测提示TCA-8113全克隆可能含有更高比例的舌癌干细胞特征样细胞群。