线粒体复合体Ⅴ即F1F0-ATPase,位于线粒体内膜基质一侧,由球状的F1头部和嵌在内膜的F0组成。F1亚复合体是ATP合成的最关键部位,由α3β3六聚体和中心柄γ、δ、ε组成。F1亚复合体组装因子1（ATPAF1,ATP synthase mitochondrial F1complex assembly factor 1）和F1亚复合体组装因子2（ATPAF2,ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 2）的催化结合位点分别与β亚基和α亚基结合形成ATPAF1-β和ATPAF2-α,ATPAF1、ATPAF2是参与F1组装的关键因子,其分子量分别为36 k Da和33 k Da。目前,关于呼吸链复合体Ⅴ组装的调控机制尚不清楚。在水稻种子老化的关键节点,编码呼吸链复合体Ⅴ的基因及其编码蛋白表达水平均发生较大的改变,严重阻碍ATP合成和中间物质的形成,是探讨呼吸链复合体Ⅴ组装调控机制的理想时间点。本研究以水稻“日本晴”（野生型,WT）及其转基因植株OsATPAF1-OE、OsATPAF1-RNAi、OsATPAF2-OE及OsATPAF2-RNAi的种子为材料,进行不同时间老化处理,通过BN-PAGE（Blue-Native PAGE）分离和纯化线粒体复合体Ⅴ,并通过Western-Blot分析不同种类复合体Ⅴ亚基蛋白的表达丰度,结合基因表达水平分析,探讨水稻种子生活力关键节点线粒体复合体Ⅴ组装的调控机制。主要结果如下:1.日本晴（WT）、OsATPAF1-RNAi、OsATPAF1-OE、OsATPAF2-RNAi、OsATPAF2-OE的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均随着老化程度的加深逐渐降低。与野生型相比,四种转基因植株的种子千粒重更小、种子活力达到关键节点所需的时间更短,在关键节点处萌发的幼苗根长和苗长更短。2.苹果酸脱氢酶（MDH）的活性随种子老化而降低,OsATPAF1-RNAi材料和OsATPAF2-RNAi材料的MDH活性始终低于野生型,而OsATPAF1-OE材料和OsATPAF2-OE材料的MDH活性高于野生型。随着老化程度的加深,水稻种子的ATP酶活性逐渐降低,且OsATPAF1-RNAi和OsATPAF2-RNAi的ATP酶活性低于野生型,OsATPAF1-OE和OsATPAF2-OE的ATP酶活性高于野生型。以NADH为底物的呼吸速率与以琥珀酸为底物的呼吸速率均随着种子生活力的降低显著下降,且OsATPAF1和OsATPAF2的过表达和RNA干扰材料的活力降至关键节点时,以NADH为底物的耗氧呼吸速率和以琥珀酸（SUCC）为底物的耗氧呼吸速率要高于野生型,但实际呼吸速率极低,显著低于野生型。3.与未老化的对照相比,在关键节点处线粒体复合体Ⅴ二聚体的含量降低,而单体的含量上升。OsATPAF1和OsATPAF2过表达和RNAi干扰会影响线粒体复合体Ⅴ的二聚化,从而影响其功能,而在关键节点处,由于二聚体解聚成单聚体,过表达和RNA干扰对单聚体的影响不大,进一步说明ATPAF1和ATPAF2主要是影响线粒体复合体Ⅴ的二聚体形成。4.OsATPAF1蛋白、OsATPAF2蛋白以及mt-7蛋白在日本晴（WT）和转基因材料中的表达趋势一致,随着发芽率的降低,呈上调表达。ATP-β蛋白和mt-27蛋白在日本晴（WT）和转基因材料中的表达趋势也一致,随着发芽率的降低,呈下调表达。ATP-S蛋白在日本晴（WT）、OsATPAF1-OE、OsATPAF2-OE及OsATPAF2-RNAi材料中随着发芽率的降低,呈上调表达,在OsATPAF1-RNAi材料中,在发芽率为90%时达到最低表达量,随后表达量逐渐上升。mt-33蛋白在日本晴（WT）和转基因材料中的表达趋势一致,随着发芽率的降低,表达量先降低后上升,在关键节点后表达量逐渐上升。5.随着种子老化程度的加深,ATPAF1、ATPAF2的表达量上升,F1的组装能力上升;ATP23表达量上升,F0的组装能力上升;OSCP和Oxa1表达量下降,复合体Ⅴ单体的组装能力降低;IF1和g的表达下降、复合体Ⅴ二聚体的组装能力下降。这表明,在水稻种子生活力丧失关键节点,通过抑制复合体Ⅴ的组装,抑制了复合体Ⅴ活性,从而减少ATP的合成。复合体Ⅴ组装受抑制影响的程度由大到小依次为:复合体Ⅴ二聚体>复合体Ⅴ单体>F1和F0亚基。上述结果表明:OsATPAF1、OsATPAF2过表达或者RNA干扰都在一定程度上对种子的发育产生了影响。OsATPAF1和OsATPAF2的过表达和RNA干扰影响了线粒体的呼吸速率和呼吸酶活性,也影响了线粒体复合体Ⅴ关键蛋白表达和其基因表达,从而影响线粒体复合体Ⅴ的组装和功能。