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硫化氢(Hydrogen sulfide，H2S)是一种多功能新型气体信号分子，能够参与生物体内信号转导和生理反应。在哺乳动物体内，H2S可舒张血管以调节血压、保护心血管或神经系统免受氧化应激损伤、调节线粒体中的代谢平衡或离子稳态、参与内质网中蛋白质与脂质的合成以及调节激素分泌等生理过程。研究发现内源性H2S合成酶主要包括胱硫醚γ-裂解酶(CSE)、胱硫醚β-合酶(CBS)和3-巯基丙酮酸硫转移酶(3MST)，其中CSE是外周器官或组织中产生H2S的关键酶。
骨骼肌是一种多系统参与调控的可塑性器官，负责骨骼运动、维持姿势和储存营养物质等过程。本研究以骨骼肌为对象，在肌肉发生或萎缩的生理或病理过程中研究H2S巯基化金属硫蛋白(metallothionein-1，MT-1)响应氧化胁迫、H2S参与高尔基体的应激反应以及H2S代谢过程对细胞内Ca2+内稳态等方面的影响，来阐述硫化氢信号在骨骼肌功能中的作用与机制。主要研究结果如下。
1.小鼠骨骼肌成肌细胞(C2C12)随着CdCl2浓度升高其细胞活力呈现剂量依赖性下降。使用CdCl2(30μmol·L-1)处理C2C12细胞可导致活性氧(ROS)水平上升、自由巯基的含量下降和细胞凋亡，骨骼肌组织表现出较大面积的坏死细胞碎片区域。同时细胞内CSE的表达量和H2S产率显著增加，而3MST的蛋白水平没有发生显著变化。PPG或2-KA处理细胞，发现3MST不参与响应Cd诱导的细胞死亡。H2S的外源供体NaHS处理可减少细胞死亡或骨骼肌组织损伤，降低ROS水平、恢复胞内自由巯基的含量，阻止组织中细胞坏死。Cd还可导致转录因子MTF-1的表达水平升高，而细胞内MT-1表达降低时Cd诱导的氧化损伤或细胞死亡加剧。Cd胁迫下，细胞CSE蛋白表达量增加，MT-1缺失突变体中CSE蛋白表达量减少；而CSE敲除突变体与正常细胞中MT-1表达量几乎不变。外源NaHS处理C2C12细胞，可上调巯基化的MT-1表达水平。CdCl2处理显著增加细胞内游离Zn2+的离子强度，外源H2S处理恢复Cd胁迫下细胞内游离的Zn2+水平。即H2S能够通过巯基化或稳定Zn-蛋白复合物对MT-1进行翻译后修饰。
2.莫能菌素(Mone )或布雷菲德菌素A(BFA )处理C2C12细胞可上调GM130和ATP2C1的表达水平，诱导高尔基体的碎片化，增强小鼠成肌细胞的氧化损伤或细胞凋亡水平，促进剪切后caspase3或caspase7的蛋白表达；提高细胞内Ca2+水平与ROS水平；同时上调CSE的表达，促进依赖CSE的内源H2S产生。外源性H2S处理可缓解高尔基胁迫下的氧化损伤、保护高尔基体的完整性，而抑制CSE/H2S系统使高尔基应激反应增强，同时上调MuRF-1或Atrogin-1的表达。BAPTA螯合胞内的Ca2+水平，可减轻上述损伤变化，诱导ATP2C1的蛋白表达。ATF4缺失会降低CSE对高尔基胁迫的响应。使用血管紧张素II(AngII)或BFA均可引起小鼠体内高尔基应激反应或骨骼肌萎缩。CSE缺失小鼠在给药后症状显著恶化，而生理浓度的NaHS能够缓解小鼠的应激反应。
3.与10周龄小鼠相比，51周龄小鼠体重下降，其胫前肌(tibial anterior ，TA)中CSE表达量下降，H2S产率显著降低；肌肉调节因子(MRFs)中Myogenin表达量减少约50%，而PAX7和Vimentin分别增加约50%和45%，CSE缺失恶化了衰老过程中的肌肉萎缩现象，使MRFs表达量显著增加。采用心脏毒素(cardiotoxin或CTX)在野生型(WT)或CSE敲除(knockout，KO)小鼠体内诱导并构建骨骼肌损伤模型，肌肉出现了不同程度的降解，同时上调了Myogenin、MyoD和Myosin的表达。CSE敲除小鼠的肌肉纤维平均横截面积显著减少，与WT相比增强了Myogenin下调和PAX7上调表达，而外源施加NaHS能够恢复TA的正常肌肉结构，诱导4种基因的正常转录水平。
4.分化培养基中培养细胞，能够显著诱导MEF2c或MRF4的蛋白表达水平；尽管外源NaHS处理能够诱导细胞分化，但是不能进一步增强上述两种蛋白的表达量。一方面，MEF2c的特异性抗体能够将MRF4蛋白沉淀下来，且在分化培养基中额外添加NaHS促进了异二聚体MEF2c-MRF4复合体的形成；另一方面，MRF4或MEF2c均可以与Myogenin基因的启动子结合，H2S处理能够增强复合体的稳定性，促进肌肉分化。肌肉发生过程中，CyclinD1和CyclinD3的蛋白表达受到抑制、F-actin蛋白水平增加且出现细胞的多核化，而外源NaHS处理能够进一步强化这些现象，并抑制细胞迁移。
综上所述，本论文利用AngII、BFA、CTX等构建小鼠的肌肉损伤或氧化损伤模型；利用MTT法、siRNA转染、实时荧光定量PCR、免疫印迹、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀、亚甲基蓝-HPLC联用、细胞或组织切片染色、生物素开关法等体外实验，证明了CSE/H2S信号通路在抵御重金属Cd胁迫、维持高尔基体完整或细胞内Ca2+稳态、保护骨骼肌免受年龄依赖性肌萎缩或CTX灌注损伤和促进肌肉再生过程中的重要作用，为急慢性肌病的治疗提供了候选因素及治疗方案。
骨骼肌是一种多系统参与调控的可塑性器官，负责骨骼运动、维持姿势和储存营养物质等过程。本研究以骨骼肌为对象，在肌肉发生或萎缩的生理或病理过程中研究H2S巯基化金属硫蛋白(metallothionein-1，MT-1)响应氧化胁迫、H2S参与高尔基体的应激反应以及H2S代谢过程对细胞内Ca2+内稳态等方面的影响，来阐述硫化氢信号在骨骼肌功能中的作用与机制。主要研究结果如下。
1.小鼠骨骼肌成肌细胞(C2C12)随着CdCl2浓度升高其细胞活力呈现剂量依赖性下降。使用CdCl2(30μmol·L-1)处理C2C12细胞可导致活性氧(ROS)水平上升、自由巯基的含量下降和细胞凋亡，骨骼肌组织表现出较大面积的坏死细胞碎片区域。同时细胞内CSE的表达量和H2S产率显著增加，而3MST的蛋白水平没有发生显著变化。PPG或2-KA处理细胞，发现3MST不参与响应Cd诱导的细胞死亡。H2S的外源供体NaHS处理可减少细胞死亡或骨骼肌组织损伤，降低ROS水平、恢复胞内自由巯基的含量，阻止组织中细胞坏死。Cd还可导致转录因子MTF-1的表达水平升高，而细胞内MT-1表达降低时Cd诱导的氧化损伤或细胞死亡加剧。Cd胁迫下，细胞CSE蛋白表达量增加，MT-1缺失突变体中CSE蛋白表达量减少；而CSE敲除突变体与正常细胞中MT-1表达量几乎不变。外源NaHS处理C2C12细胞，可上调巯基化的MT-1表达水平。CdCl2处理显著增加细胞内游离Zn2+的离子强度，外源H2S处理恢复Cd胁迫下细胞内游离的Zn2+水平。即H2S能够通过巯基化或稳定Zn-蛋白复合物对MT-1进行翻译后修饰。
2.莫能菌素(Mone )或布雷菲德菌素A(BFA )处理C2C12细胞可上调GM130和ATP2C1的表达水平，诱导高尔基体的碎片化，增强小鼠成肌细胞的氧化损伤或细胞凋亡水平，促进剪切后caspase3或caspase7的蛋白表达；提高细胞内Ca2+水平与ROS水平；同时上调CSE的表达，促进依赖CSE的内源H2S产生。外源性H2S处理可缓解高尔基胁迫下的氧化损伤、保护高尔基体的完整性，而抑制CSE/H2S系统使高尔基应激反应增强，同时上调MuRF-1或Atrogin-1的表达。BAPTA螯合胞内的Ca2+水平，可减轻上述损伤变化，诱导ATP2C1的蛋白表达。ATF4缺失会降低CSE对高尔基胁迫的响应。使用血管紧张素II(AngII)或BFA均可引起小鼠体内高尔基应激反应或骨骼肌萎缩。CSE缺失小鼠在给药后症状显著恶化，而生理浓度的NaHS能够缓解小鼠的应激反应。
3.与10周龄小鼠相比，51周龄小鼠体重下降，其胫前肌(tibial anterior ，TA)中CSE表达量下降，H2S产率显著降低；肌肉调节因子(MRFs)中Myogenin表达量减少约50%，而PAX7和Vimentin分别增加约50%和45%，CSE缺失恶化了衰老过程中的肌肉萎缩现象，使MRFs表达量显著增加。采用心脏毒素(cardiotoxin或CTX)在野生型(WT)或CSE敲除(knockout，KO)小鼠体内诱导并构建骨骼肌损伤模型，肌肉出现了不同程度的降解，同时上调了Myogenin、MyoD和Myosin的表达。CSE敲除小鼠的肌肉纤维平均横截面积显著减少，与WT相比增强了Myogenin下调和PAX7上调表达，而外源施加NaHS能够恢复TA的正常肌肉结构，诱导4种基因的正常转录水平。
4.分化培养基中培养细胞，能够显著诱导MEF2c或MRF4的蛋白表达水平；尽管外源NaHS处理能够诱导细胞分化，但是不能进一步增强上述两种蛋白的表达量。一方面，MEF2c的特异性抗体能够将MRF4蛋白沉淀下来，且在分化培养基中额外添加NaHS促进了异二聚体MEF2c-MRF4复合体的形成；另一方面，MRF4或MEF2c均可以与Myogenin基因的启动子结合，H2S处理能够增强复合体的稳定性，促进肌肉分化。肌肉发生过程中，CyclinD1和CyclinD3的蛋白表达受到抑制、F-actin蛋白水平增加且出现细胞的多核化，而外源NaHS处理能够进一步强化这些现象，并抑制细胞迁移。
综上所述，本论文利用AngII、BFA、CTX等构建小鼠的肌肉损伤或氧化损伤模型；利用MTT法、siRNA转染、实时荧光定量PCR、免疫印迹、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀、亚甲基蓝-HPLC联用、细胞或组织切片染色、生物素开关法等体外实验，证明了CSE/H2S信号通路在抵御重金属Cd胁迫、维持高尔基体完整或细胞内Ca2+稳态、保护骨骼肌免受年龄依赖性肌萎缩或CTX灌注损伤和促进肌肉再生过程中的重要作用，为急慢性肌病的治疗提供了候选因素及治疗方案。