棉铃虫核型多角体病毒ORF115a和ORF127基因的克隆及表达

来源 :河南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:huanyingchangmaoshou
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
棉铃虫是一种重要的农业害虫,危害多种农作物,给棉花生产带来巨大损失,而且对多种化学农药产生了严重的抗药性。棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒(Helicoverpa armigera single NPV,HaSNPV)是专性侵染棉铃虫杆状病毒。随着分子生物学的发展,有许多基因的功能被了解清楚,例如HaSNPV ORF128基因,HaSNPV ORF135基因等,但是,还有许多基因的功能是未知的,例如:HaSNPV ORF115a基因和HaSNPV ORF127基因。在本研究中,作者对HaSNPV ORF115a和HaSNPV ORF127基因进行了生物学信息分析,克隆了这两个基因,并在大肠杆菌中进行了表达,为下一步功能的分析打下基础。本研究的主要结论如下: 1 HaSNPV ORF115a基因的初步研究结果 HaSNPV ORF115a位于HaSNPV C1菌株基因组中109,493bp和110,419bp之间,编码区有926bp,编码一个308氨基酸的多肽,分析表明:其分子量为37.135KDa,等电点为5.14。利用ExPASy server对HaSNPV 115a基因推测的蛋白序列进行分析,结果发现在所推测氨基酸序列中不存在信号肽序列、转膜区、核定位区和膜滞留区,但在838-851核苷酸处发现一些重要的基序,这些基序包括:1个Thiolases actire位点、1个Thiolases acyl-enzyme intermediate signature和1个Thiolases signature。通过对HaSNPV ORF115a的进化分析发现HaSNPV ORF115a与美洲棉铃虫核型多角体病毒同源关系最近。 根据已发表的GenBank中已登录的HaSNPV C1株基因组的核苷酸序列(GenBank登录号为AF303045)设计并合成引物,以HaSNPV C1株基因组为模板,利用PCR技术扩增到HaSNPV ORF115a基因,并将其连接至pMD18-T Easy载体上,并利用设计的酶切位点将目的基因从T载体上切下。在T4 DNA Ligase酶连接作用下,将ORF115a目的基因与DGEX-4T-2载体连接。连接产物经转化并用BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切鉴定,得到表达载体质粒pGEX-4T-2-ORF115a;经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳,与对照相比在63KDa左右出现一条特异性高浓度条带,pGEX/Ha115经IPTG诱导后产生的与预期分子量的大小相符。经Western blotting分析进一步证实,63KDa的特异性条带与抗GST抗体发生很强的印迹反应。这说明DGEX/Ha115a经IPTG诱导后产生的63KDa的特异性条带是Ha115a与GST融合的蛋白。 2 HaSNPV ORF127基因的初步研究结果 通过对HaSNPV ORF127基因核苷酸序列进行了生物学信息分析,HaSNPV ORF127位于HaSNPV C1菌株基因组的119,723bp和120,301bp之间,编码框有578个核苷酸,编码192个氨基酸残基,利用http://www.expasy.ch/tools/网站对HaSNPV ORF127基因编码的氨基酸序列进行分析发现,其分子量为22.567 KDa,等电点为9.82。通过对HaSNPV ORF127的进化分析发现HaSNPV ORF127与HzSNPV ORF131同源关系最近。
其他文献
辣椒疫病(Pepper Phytophthora blight)是辣椒生产上重要的真菌性病害,在世界上广泛分布,严重威胁到辣椒的生产。对辣椒疫病的防治,目前主要采用化学防治为主的防治技术。辣