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目的:构建靶向EGFR短发夹RNA(shRNA)重组质粒载体并转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,观察其转染效率及对EGFR基因mRNA和蛋白表达的抑制效应,筛选出能高效且特异阻断EGFR基因表达的重组质粒载体。将此高效重组质粒载体转染Colo-16细胞,观察Colo-16细胞对雷帕霉素敏感性的变化及Colo-16细胞凋亡的变化并探讨其可能机制。
方法:
第一部分:靶向EGFR基因shRNA干扰载体的构建与鉴定根据RNA干扰原理,体外设计并合成4对靶向EGFR基因shRNA,即shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4;以pGPU6/GFP/Neo质粒为载体,分别构建pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA1、pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA2、pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA3、pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA4,转化入JM109大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;分别以Lipofectamine2000介导转染皮肤鳞状细胞癌Colo-16细胞,采用流式细胞术测定转染效率;收集转染48小时后的Colo-16细胞提取总RNA和总蛋白,RT-PCR和Western blot技术分别检测EGFR基因mRNA及蛋白表达水平,计算抑制率,筛选有效靶点。
第二部分: EGFR-shRNA增强Colo-16细胞对雷帕霉素敏感性和诱导Colo-16细胞凋亡的实验研究将筛选出的重组质粒载体pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA1转染Colo-16细胞,采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)测定Colo-16细胞对雷帕霉素敏感性的变化;流式细胞术检测Colo-16细胞凋亡率,Hoeehst33258荧光染色观察Colo-16细胞凋亡形态学改变;Westem blot检测EGFR、Akt、NF-κB的表达变化。
结果:
第一部分:靶向EGFR基因shRNA干扰载体的构建与鉴定酶切结果表明,所有质粒均为阳性重组质粒,测序的碱基序列与设计合成的碱基序列完全一致,证实shRNA能准确完整地导入质粒pGPU6/GFP/Neo。流式细胞术测定重组质粒对Colo-16细胞的转染效率为38.28％。RT-PCR和Western blot结果显示,与正常对照组相比,除pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA2对EGFR基因mRNA和蛋白表达水平无明显抑制作用以外,其它重组质粒对EGFR基因mRNA和蛋白均有不同程度的抑制作用(p＜0.05),其中pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA1的抑制作用最强,对EGFR基因mRNA和蛋白抑制率分别为63.35％和55.5％。
第二部分: EGFR-shRNA增强Colo-16细胞对雷帕霉素敏感性和诱导凋亡的实验研究pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNAl重组质粒载体转染Colo.16细胞后,Colo-16细胞对雷帕霉素的敏感性提高了2.44倍,细胞凋亡率达(12.65±0.091)％,与空白组相比,差异有显著性(p＜0.05)。Hoechst33258荧光染色显示Colo-16细胞核染色质出现凝聚、边集、核裂解等形态学改变。Western blot检测表明转染后Colo-16细胞EGFR、Akt、NF-κB的表达显著下调。
结论:本研究成功构建并筛选出1个高效且特异阻断EGFR基因表达的RNA干扰重组质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA1,对Colo-16细胞具有较高转染效率。pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNAl提高Colo-16细胞对雷帕霉素敏感性2.44倍,诱导Colo-16细胞凋亡,并使EGFR、Akt,NF-κB的表达显著下调。