聚Y-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,简称γ-PGA)是一种多功能的生物聚合物,具有可食用、无毒和可生物降解等特性。地衣芽胞杆菌WX-02是重要的聚Y-谷氨酸生产菌株,但菌体胞内谷氨酸合成能力较弱,在聚γ-谷氨酸发酵生产过程中需要添加大量谷氨酸,提高了发酵成本,不利于聚γ-谷氨酸的产业化开发。目前聚γ-谷氨酸代谢中的关键酶在地衣芽胞杆菌WX-02生物合成聚γ-谷氨酸中的作用仍不清楚。本研究通过分析胞内谷氨酸合成和聚γ-谷氨酸合成的代谢途径与关键步骤,并以此为基础,对地衣芽胞杆菌WX-02代谢途径中关键酶的酶学性质、胞内谷氨酸合成和聚γ-谷氨酸降解进行研究,同时利用HPLC、GC-MS和Q-RT-PCR等方法对所构建工程菌株的生理生化变化进行分析。主要结论如下：1.胞内谷氨酸的合成中,有三种酶参加反应：glnA基因编码的谷氨酰胺合成酶、gltAB基因编码的谷氨酸合成酶和分别由rocG和gudB基因编码的谷氨酸脱氢酶。本研究在Bacillus licheniformis WX-02(简称WX-02)中分别缺失rocG和gltA基因,替换rocG基因启动子,得到相关菌株WX-02△rocG、WX-02△gltA和WX-02P43rocG。经Q-RT-PCR分析发现,WX-02△rocG菌株中未检测到rocG基因转录,WX-02△gltA菌株中未检测到gltA基因转录,WX-02P43rocG菌株rocG基因转录量为WX-02菌株1.54倍。WX-02菌株中,未检测到gudB基因转录,WX-02△rocG中gudB基因转录量为WX-02△gltA菌株的4.72倍。在未添加外源谷氨酸的发酵培养基中,WX-02聚Y-谷氨酸产量为9.82g/L,WX-02△rocG和WX-02P43rocG的聚γ-谷氨酸产量分别为WX-02的54.7%和105%,WX-02△gltA的聚γ-谷氨酸产量与WX-02相比差异不显著。说明在WX-02中,负责胞内谷氨酸合成的酶为谷氨酸脱氢酶(RocG)。2.以WX-02基因组为模板扩增谷氨酸脱氢酶RocG编码基因,克隆至pET-28(+)表达载体后,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得含有重组质粒pET-28b(+)-rocG的重组大肠杆菌菌株,对其进行诱导表达和Ni柱亲和纯化,得到具有均一电泳条带的谷氨酸脱氢酶RocG蛋白。RocG的酶学性质结果表明：该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH值为8.0,温度低于40℃、pH值6.0-8.5稳定性较好。α-酮戊二酸、NADPH和谷氨酸的米氏常数Km分别为4.727mmol/L、0.111mmol/L和23.296mmol/L,α-酮戊二酸、NADPH和谷氨酸的Kcat/Km分别为1.923mmol-1?L?min-1、100.09mmol-1?L?min-1和0.159mmol-1?L?min-1。说明谷氨酸脱氢酶RocG合成谷氨酸催化反应效率比分解谷氨酸高,本研究从体外实验证明了地衣芽胞杆菌WX-02谷氨酸脱氢酶(RocG)主要起生物合成谷氨酸的功能。3.乙醛酸循环可以部分回补TCA循环从而增强胞内谷氨酸合成。aceA基因编码的异柠檬酸裂解酶和aceB基因编码的苹果酸合成酶为乙醛酸循环中关键酶。本研究以WX-02为原始菌株,分别缺失aceA基因和替换aceA基因原有启动子后得到菌株WX-02△aceA和WX-02P43aceA。经Q-RT-PCR检测后发现,WK-02△aceA菌株中未检测到aceA基因转录,WX-02P43aceA菌株中aceA和aceB基因转录量分别提高了3.6和2.8倍。在未添加外源谷氨酸的培养基中,WX-02P43aceA和WX-02△aceA的聚γ-谷氨酸产量为WX-02的115%和66.8%,说明胞内谷氨酸合成需要乙醛酸循环的回补作用,增强乙醛酸循环可以提高聚γ-谷氨酸产量。培养基中分别添加乙醛酸循环抑制剂苹果酸和琥珀酸后,WX-02中aceA基因转录量下降了14%和28%,聚γ-谷氨酸产量分别提升了13.4%和16.5%。分析原因为添加苹果酸和琥珀酸虽然抑制了乙醛酸循环途径,但由于添加物属于TCA循环中间代谢产物,增强了Ⅸ-酮戊二酸向谷氨酸合成的代谢,从而提高了聚γ-谷氨酸合成产量。4.聚γ一谷氨酸降解酶可以降解菌株合成的聚γ-谷氨酸,使其分子量减小。本研究构建了聚Y-谷氨酸降解酶基因pgdS缺失菌株WX-02△pgdS,并以pHY300PLK质粒为基础构建了对照菌株WX-02/pHY菌株和pgdS基因过表达菌株WX-02/pHYpgdS。使用GPC检测WX-02、WX-02/pHY、WK-02△pgdS和WX-02/pKYpgdS生物合成的γ-PGA相对分子量后发现,WX-02△pgdS相对分子量最大,WX-02/pHYpgdS相对分子量最小,WX-02/pHY和WX-02相对分子量一致,说明聚γ-谷氨酸降解酶PgdS可以降低B. licheniformis WX-02生物合成的γ-PGA分子量。在外源添加谷氨酸的培养基中,WX-02和WX-02/pHY聚Y-谷氨酸产量差异不显著,WX-02△pgdS聚γ-谷氨酸产量下降为WX-02的83%,WX-02/pHYpgdS与对照菌株WX-02/pHY相比,聚γ-谷氨酸产量提高54%。经Q-RT-PCR分析,WX-02△pgdS菌株中未检测到pgdS基因转录,谷氨酸转运蛋白基因gltT转录量下降为WX-02的86%,WX-02/pHYpgdS菌株pgdS和gltT基因转录相比WX-02/pHY分别提高了9.86和1.8倍。说明聚γ-谷氨酸降解酶PgdS影响外源谷氨酸向胞内转运,引起聚γ-谷氨酸合成前体物的胞内浓度变化,改变了聚γ-谷氨酸产量。