本文应用荧光相图法和高效疏水色谱研究脲和盐酸胍诱导牛血清白蛋白变性过程及其复性过程的路径,捕捉变性、复性过程中存在的部分折叠中间态;应用高效体积排阻色谱和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)研究在脲和盐酸胍变性牛血清白蛋白复性过程中聚集体的形成及成因。本论文的研究结果将为研究蛋白质折叠机理,建立统一的蛋白质折叠模型奠定基础。 荧光相图法研究牛血清白蛋白变性和复性过程,捕捉部分折叠中间态。结果表明:脲诱导牛血清白蛋白变性过程中,当有还原剂存在时,牛血清白蛋白直接从天然态转变为去折叠态,没有中间态存在;当无还原剂存在时,存在一个部分折叠中间态。盐酸胍诱导牛血清白蛋白变性过程,在有还原剂和无还原剂的条件下都符合“四态模型”,存在两个中间态。但形成中间态所需的盐酸胍浓度不同。非还原盐酸胍变性牛血清白蛋白的复性过程中存在两个复性中间态;非还原脲变性牛血清白蛋白的复性过程中存在一个复性中间态。而还原脲和盐酸胍变性牛血清白蛋白的复性过程中都存在三个部分折叠中间态,分四步进行。 用色谱法对非还原和还原脲变性牛血清白蛋白体外折叠中间体及复性聚集体进行了分离。发现对于非还原脲变性牛血清白蛋白,在高效疏水色谱上进行复性,发现其再折叠过程中存在一个部分折叠中问态,它的保留时间比天然牛血清白蛋白长,因此比天然牛血清白蛋白的疏水性要强。在体积排阻色谱柱中能成功恢复其天然构象,复性过程中无聚集体存在。对于还原脲变性牛血清白蛋白,在疏水色谱上形成聚集体,无法成功复性。在体积排阻色谱柱中也大部分以聚集体的形式存在。 用非还原和还原SDS-聚丙烯酰胺电泳研究脲变性牛血清白蛋白在脲溶液中稀释复性时聚集体形成的原因。发现非还原脲变性牛血清白蛋白在稀释复性过程中由于分子间二硫键的错配形成聚集体。还原变性牛血清白蛋白在稀释复性过程中也会形成聚集体,当复性液中脲浓度很低时,会形成沉淀。经电泳分析这些聚集体是由于疏水性很强的还原变性牛血清白蛋白分子间的疏水作用导致变性蛋白质分子大量聚集、沉淀。 综合以上实验结果可以得出以下结论:(Ⅰ)对于牛血清白蛋白的变性过程,