论文部分内容阅读
抗体的制备是小分子免疫化学分析方法的关键步骤,也是开展免疫化学研究的核心内容。为充分发挥异源免疫分析(免疫半抗原与竞争半抗原的结构不同)的优势,提高杂交瘤细胞的筛选效率,获得更高特异性或宽谱选择性的单克隆抗体,本研究选取有机磷类农药为研究对象,将异源ELISA引入到杂交瘤细胞的筛选过程中,提出并建立了一套高特异性和宽谱单克隆抗体的筛选体系。研究采用20种竞争原建立异源ELISA方法同时筛选杂交瘤细胞,获得了10株单克隆抗体,其中新制备得到的抗对硫磷高特异性单克隆抗体与传统方法(同源ELISA方法,免疫半抗原与竞争半抗原的结构相同)制备的5H7抗体相比,基于前者所建立的ELISA方法具有更高的方法灵敏度。而交叉反应率试验结果表明,新制备的抗体5D11与5F7具有宽谱选择性,其中基于5F7抗体所建立的异源ELISA方法可以用来检测对硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷和辛硫磷五种有机磷农药,IC50分别为7.06 ng/mL、32.34 ng/mL、164.84 ng/mL、500.94 ng/mL和96.97 ng/mL。根据不同抗原-抗体组合的ELISA方法表现,研究确定了采用异源ELISA方法进行抗体筛选时的包被半抗原设计原则,并设计对硝基苯甲酸为包被半抗原来验证前期所提出的抗体筛选制备体系和方法,获得了一株宽谱特异性单克隆抗体2H6。基于2H6建立的同源和异源ELISA方法可以用来检测对硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷和水胺硫磷,最佳抗原-抗体组合的IC50分别为20.32 ng/mL、21.44 ng/mL、42.15 ng/mL和58.85 ng/mL。土壤样品中四种农药的单一添加和混合添加回收率试验结果表明,2H6抗体不仅可以用于土壤样品中四种有机磷的单一农药残留检测,而且其还可以用于对硫磷+甲基对硫磷的混合定量测定。而对于四种农药同时存在时,该方法可以用于农药残留是否超标的阳性判定,是仪器定量检测前的一种快速有效的初筛方法。在获得多种高特异性和宽谱单克隆抗体的基础上,本研究进一步采用分子模拟的方法对高特异性和宽谱抗体间识别特性差异的内在原因进行了探讨.研究采用Accelrys公司的Discovery StudioTM软件系统,通过同源建模法构建了高特异性单抗5H7和两种宽谱单抗5F7和5D11的可变区三维模型,进一步采用LibDock模块模拟对接了有机磷农药与三株抗体之间的分子互作行为,确定了抗体与农药分子互作的关键氨基酸残基.分子模拟的结果表明：三株抗体与农药间的相互作用主要包括疏水相互作用、范德华力、氢键和π-π作用；CDR区特别是HCDR3区的氨基酸残基是抗体与农药分子互作的关键氨基酸残基,而且HCDR3区的苏氨酸(thr)是产生对硫磷高特异性的关键氨基酸,而丝氨酸(ser)和色氨酸(trp)则与抗体的选择性有密切联系.这些氨基酸作用位点和作用方式的确定,为下一步抗体的改造和宽谱基因工程抗体的制备打下了坚实的基础。