随着人们对骨代谢疾病的重视,研究不同因子对成骨细胞(osteoblast,OB)的影响已成为当今热点。OB有形成骨骼、调节细胞外骨基质成分的构成以及骨基质矿化的功能。因此,OB功能状态与骨骼生长塑造、再造及骨质疏松的发展有着极其密切的联系。有些疾病可以通过增加OB的数量或增强OB的活性而引起骨量的增加。钙和磷是骨骼的重要物质成分,骨代谢过程必然涉及动物机体对钙、磷的吸收和代谢。摄入充足的钙、磷对保持动物的骨骼完好至关重要。体内钙、磷代谢的平衡和钙磷在细胞内、外液中浓度的稳定对维持正常骨代谢有重要作用。因此,建立一种快速获得OB的培养方法,研究钙、磷对OB体外增殖、分化及矿化的影响,对骨质疏松症的研究有重要的理论和指导意义。本试验选用5 d SD大鼠头盖骨作为试验用OB的来源,通过胰蛋白酶预消化后,剪碎,经Ⅱ型胶原酶消化获得细胞,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、钙化结节染色鉴定,经台盼蓝染色、“反复贴壁法”纯化后,进行了成活率和纯度分析,用MTT法检测了一个生长周期内OB的活性分布,成功建立了SD大鼠头盖骨OB体外培养模型;在体外培养的基础上,在培养液中添加不同浓度的钙、磷及其比例,共分9组,分别为不添加任何成分的对照组、添加1、2、4 mmol/L钙组、添加1、2、4 mmol/L磷组、钙磷比1∶2(添加1 mmol/L钙+2 mmol/L磷)组和钙磷比2∶1(添加2 mmol/L钙+1 mmol/L磷)组。分别从OB的形态学、OB分泌ALP活性、OB分泌蛋白、Ⅰ型胶原(collagen type I,Col-I))、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的含量、OB表达ALP、Col-I、OPN、骨钙素(bone glaprotein,BGP)mRNA的含量及OB内Ca2+沉积及体外钙化等指标进行了分析,详细的研究了钙、磷及其比例对乳鼠头盖骨OB增殖、分化及矿化的影响。结果表明,①本试验培养的头盖骨OB,经ALP染色鉴定,并计数,OB纯度高达98.06%,台盼蓝染色计数分析,原代OB成活率为88.69%,传代的OB成活率高达94.12%,且在一个生长周期内,在第3、4 d进入对数生长期,细胞融合并开始重叠生长,在第7 d达到峰值,并进入钙化期,随后细胞进入衰减期。因此,本试验将选择在细胞融合时定为钙、磷处理OB的时间点,检测处理后第2、5、8 d的各种指标;②与对照组比较,添加钙各组均促进OB增殖,且有剂量效应,钙4 mmol/L从第2 d开始差异显著(P<0.05),钙1、2 mmol/L从第5 d开始差异显著(P<0.05),而钙磷比(2:1、1:2)只在第8 d差异显著(P<0.05)。而添加磷对OB增殖作用影响不明显。③与对照组比较,添加钙使OB胞体饱满,表面针状突起增多,形态结构无破损,细胞膜、核膜完整,线粒体轻度肿胀,添加磷及不同钙磷比使OB胞体扁平,针状突起减少,但形态结构无破损,细胞膜、核膜完整。④与对照组比较,添加钙、磷及其比例在第2、5、8 d均抑制细胞内ALP活性(P<0.05),在第5 d抑制其mRNA的表达(P<0.01),但在第2、8 d却促进其mRNA的表达(P<0.05)。⑤与对照组比较,添加钙、磷及其比例各试验组除1 mmol/L钙外,在第2 d均促进Col-I分泌(P<0.01),钙各组和1 mmol/L磷在第5 d和钙各组和1、2 mmol/L磷和钙磷比(2:1)在第8 d均抑制其分泌(P<0.05或P<0.01),在第2、8 d均促进其mRNA表达(P<0.01),在第5 d除钙磷比(1:2)外均抑制其mRNA表达(P<0.01)。⑥与对照组比较,添加钙、磷及其比例作用后,各试验组均促进OPN mRNA的表达(P<0.01),除第2 d钙1、2 mmol/L组外,均促进其分泌(P<0.05)。⑦与对照组比较,添加钙、磷及其比例作用后,各试验组均促进BGP mRNA的表达(P<0.01)。⑧与对照组比较,添加钙、磷及其比例作用后,各试验组均能促进OB内Ca2+的沉积及体外钙化。表明,钙(1、2、4 mmol/L)及钙磷比(1∶2 ,2∶1 )能促进OB增殖、分化及体外钙化,利于新骨的形成。磷(1、2、4 mmol/L)能促进OB的分化及体外钙化,但对增殖作用不明显。