鳗鲡是世界主要水产养殖种类之一，中国是最大的生产国，总产量约占世界的70％。随着养殖集约化程度的提高，病害及药物残留问题日益突出，并严重制约着鳗鲡产业的可持续性发展。抗菌肽具有高效广谱的抗菌活性和不易产生耐药性等特点，可在鱼病防治中起重要作用，因此倍受关注。本研究采用高效液相色谱和分子生物学技术，从日本鳗鲡（Anguilla japonica）肝脏分离鉴定了一个血红蛋白源性的抗菌肽;并克隆和原核表达了两个cathelicidin基因变体。主要研究成果如下:　　 1、抗菌肽的分离与纯化　　 本研究分离纯化得到一个血红蛋白源抗菌肽。实验采用醋酸浸提，阳离子交换和反相高效液相层析分离技术，从养殖的健康日本鳗鲡肝脏内获得一个单一组分。该组分为11.30μM时，对迟钝爱德华氏菌抗菌活性较强，杀菌指数(Ki％)为88.64％±3.91％。经质谱分析，分子量为2388.05，Edaman降解法测定N-末端18个氨基酸残基序列为H-FAHWPDLGPGSPSVKKHG-OH。与欧鳗（A.Anguilla）的血红蛋白α链部分序列相似度达94％，可能为血红蛋白的降解片段，因此，命名为AjHbα。　　 2、AjHbα氨基酸的全长序列分析　　 本研究获得AjHbα完整的氨基酸序列。实验根据已知的18个氨基酸序列，设计简并引物，利用RACE技术，克隆获得AjHbα完整的cDNA序列，结合质谱所测AjHbα的分子量，推测AjHbα完整的氨基酸序列为H-FAHWPDLGPGS()PSVKKHGKVIM-OH。应用生物学软件分析该抗菌肽为一两亲性的弱阳离子抗菌肽，电荷为+2，pI为9.27。　　 3、AjHbα的抗菌活性分析　　 本研究发现AjHbα具有较强的抗菌活性。实验采用微孔液体培养法检测人工合成的AjHbα的抗菌活性，结果表明AjHbα具有广谱的抗革兰氏阳性和阴性细菌的活性。浓度为83.72μM时，可杀灭革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌）和阴性菌（迟钝爱德华氏菌、哈维氏弧菌、豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌、简达气单胞菌、威隆气单胞菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌），Ki％达到95％以上。浓度为41.86μM时，对上述革兰氏阴性菌的后六株抗菌活性较强，Ki％达到70％以上。　　 4、Cathelicidin基因的克隆　　 本研究克隆得到两个cathelicidin基因变体。实验根据已知的日本鳗鲡cathelicidin EST标签，设计引物，克隆得到两条cathelicidincDNA序列，分别命名为Ajcath1、Ajcath2（GenBank登录号为AFP72291和AFP72292）。两条cDNA序列都包含完整的cathelicidin编码区及非编码区，序列末端都具有明显的多腺苷酸化加尾信号。根据推导的氨基酸序列，两条均由信号肽、结构域和成熟肽三部分组成，靠近C端有四个保守的半胱氨酸序列。根据已知鱼类的cathelicidin成熟肽序列及嗜中性粒细胞弹性蛋白酶酶切位点，推测Ajcath1成熟肽序列为H-RMRRSKAGKGSGGNKGNKGSGGNKGNKGSRPGGGSSIAGRDKG()DSGTRTA-OH，分子量为4818.2Da，pI值为12.02，电荷+11，是一个富含甘氨酸的强阳离子抗菌肽。Ajcath2成熟肽序列为H-TDPEERKKLSEPPSWTKYFSN()W-OH，分子量为2726.0Da，pI值为5.93，电荷为0。Ajcath2与其他已知鱼类cathelicidin无相似性，具有其它鱼类罕见的cathelin高度保守区，可能为新发现的鱼类抗菌肽。　　 5、Ajcath1和Ajcath2重组蛋白的表达　　 本研究获得日本鳗鲡cathelicidin重组表达产物。实验根据Ajcath1和Ajcath2cDNA序列，经过引物末端加接头除去信号肽序列，分别构建了pET-28a/cathelicidin表达载体，并在大肠杆菌内成功表达出cathelicidin重组蛋白。Ajcath1在菌体密度为OD600=0.3，诱导剂浓度为0.1mM，42℃诱导表达7h条件下，重组蛋白表达量最高;Ajcath2表达条件为:菌体密度为OD600=0.3，诱导剂浓度为0.1mM，37℃诱导表达4h。对以包涵体形式存在的重组蛋白，应用亲和层析柱、AKTA-purifier100纯化系统及透析法，得到较高纯度的cathelicidin重组蛋白，为进一步研究cathelicidin成熟肽序列及抗菌活性奠定基础。　　 本研究从日本鳗鲡肝脏分离得到一个具有广谱抗菌活性的血红蛋白源抗菌肽，并克隆得到两个cathelicidin基因变体，在大肠杆菌内表达出两个重组蛋白。该成果为抗菌肽作为鱼类疾病防治新途径奠定了基础。