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植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇和磷酸及磷酸盐的一类酶,将其添加到单胃动物植物性食品与饲料中,可以使植酸水解成肌醇和磷酸而被单胃动物所利用,而且释放被植酸络合的Ca2+、Mg2+、Za2+等矿物元素和一些蛋白质,从而解除植酸的抗营养作用、提高食品与饲料的利用率、促进动物生长、减少了动物粪便中磷的残留量、降低环境的磷污染。 植酸酶在动物、植物和微生物中均有发现。微生物植酸酶由于种类丰富、表达量相对较大、容易提取而成为商品植酸酶的重要来源。虽然国内外已经有数种植酸酶商品问世,但还没有一种非常完美的产品。利用诱变和基因工程手段改善植酸酶性质、提高植酸酶生产能力是当今植酸酶研究的主要方向。 本实验室从土壤中筛选到一株植酸酶活力较高的霉菌——黑曲霉A3214;对黑曲霉A3214进行紫外线诱变和亚硝基胍诱变后获得植酸酶活力提高22%的诱变株N14;利用N14的植酸酶基因构建植酸酶基因工程酵母,获得植酸酶活力达1.4×105u/mL的植酸酶基因工程酵母E22。 本研究对黑曲霉A3214、N14以及基因工程酵母E22所产的植酸酶分别进行分离纯化并研究其纯酶的各种酶学性质,主要研究与结果如下。 1.利用相应培养基对A3214、N14以及E22进行液体发酵培养,过滤离心后获得相应植酸酶粗酶液,通过丙酮沉淀分离、sephadex G150分子筛层析和sepharose fast flow离子交换层析分离纯化,获得电泳纯的A3214、N14以及E22植酸酶液,纯酶的酶活回收率分别为5.6%、7.1%和1.4%。 2.37℃下测定A3214、N14以及E22的植酸酶纯酶分别在pH为2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0时的酶活,表明A3214植酸酶和N14植酸酶的最适pH均为2.5,E22植酶有两个最适pH峰,分别为pH2.5—pH3.0和pH5.5。在最适pH下测定A3214、N14以及E22的植酸酶纯酶分别在温度为37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃时的酶活,表明A3214植酸酶和N14植酸酶的最适温度均为50℃左右,E22植酸酶在pH2.5时的最适温度为45℃左右、在pH5.5时的最适温度为55℃。 3.将A3214、N14以及E22的植酸酶纯酶液分别在60℃、70℃、80℃、85℃下保温10分钟后在37℃、最适pH下测活,以不进行热处理的植酸酶为对照,结果表明A3214植酸酶、N14植酸酶以及E22植酸酶均具有较好的耐热性。A3214植酸酶和N14植酸酶在60℃保温10分钟后酶活保留均在80%左右,E22植酸酶在85℃保温10分钟后酶活保留在70%左右。 用胃蛋白酶1mg/mL在pH2.5下,胰蛋白酶1mg/mL在pH5.5下,37℃处理A3214、N14以及E22的植酸酶纯酶液6小时后测定植酸酶酶活性,以不进行蛋白酶处理的植酸酶为对照,结果表明A3214植酸酶和N14植酸酶对胃蛋白酶具有弱敏感性,酶活保留90%左右;而E22植酸酶对胃蛋白酶不敏感,酶活性几乎完全保留,但它对胰蛋白酶具有弱敏感性,酶活保留